房守敏

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南充 637002)

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是一個多功能的酶系,廣泛分布于生物體[1]。昆蟲GST s的主要功能是對外源有毒物質(zhì)解毒,參與抗藥性的形成[2]。昆蟲GSTs的部分成員也具有硒非依賴性的谷胱甘肽過氧化物酶(non-selenium dependent glutathione peroxidases,non-SeGPx)活性,是昆蟲體內(nèi)重要的抗氧化酶。如殺蟲劑進入生物體內(nèi),能打破體內(nèi)氧化和抗氧化的動態(tài)平衡,大量產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)對膜(包括細胞膜和亞細胞器膜)脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)及糖類等生物大分子造成氧化損傷,進而產(chǎn)生新的細胞毒素和誘變劑引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[3-6]。具有過氧化物酶活性的GSTs能對脂質(zhì)過氧化中間產(chǎn)物磷脂過氧化氫(phospholipid hydroperoxides)和脂肪酸過氧化氫(fatty acid hydroperoxides)及終產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde,MDA)和4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)等有機氫過氧化物解毒[5],從而降低殺蟲劑對生物體引起的氧化應(yīng)激損傷。

近年來,昆蟲GSTs的研究報道越來越多。對昆蟲GSTs的主要集中于其與殺蟲劑抗性的關(guān)系,已有研究發(fā)現(xiàn)GSTs在昆蟲對有機磷(organophosphorus,OPs)、有機氯(organochlorine)和擬除蟲菊酯(pyrethroid)等殺蟲劑形成抗性中起著重要作用。國內(nèi)外研究者對GST s參與殺蟲劑抗性的生化和分子基礎(chǔ)進行了綜述[2,7-9]。GSTs基因的分類、結(jié)構(gòu)、及調(diào)控機制相關(guān)研究也有一些綜述進行了報道[7,9-11]。2005年,邱星輝對殺蟲劑抗性遺傳學(xué)與基因組學(xué)研究進展進行了綜述,其中重點論述了細胞色素P450和酯酶[12],而昆蟲GSTs的基因組學(xué)研究還未見綜述報道。隨著部分昆蟲基因組全序列的測序完成以及基因組研究技術(shù)(如微陣列技術(shù))的廣泛運用,促進了抗性基因的鑒別進程,比較基因組學(xué)研究也不斷出現(xiàn)。因此,本文綜述了昆蟲GSTs的比較基因組學(xué)研究及GSTs參與殺蟲劑抗性的研究進展。

1 昆蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的比較基因組學(xué)研究

隨著基因組時代的來臨,昆蟲GSTs的全基因組鑒定與比較基因組學(xué)逐漸展開。目前,已完成全基因組鑒定的昆蟲GST基因數(shù)目見表1。如表所示,不同物種間基因數(shù)目存在較大的差異,特別是蜜蜂Apismelli f era基因組中的GST基因僅有8個。半數(shù)以上的GST基因均分布于昆蟲特異的Delta和Epsilon家族(除蜜蜂外),按蚊的2個昆蟲特異家族的基因數(shù)達到總數(shù)的70%以上。Delta和Epsilon隨著昆蟲分化而進化形成,相對其他家族其進化產(chǎn)生的時間較晚,系統(tǒng)發(fā)生分析表明它們與Theta家族近源(圖1)[13-16]。由于Delta和Epsilon家族在物種內(nèi)的特異擴增,因此鑒定物種間的直系同源基因較為困難[13]。岡比亞按蚊Anopheles gambiae、埃及伊蚊Aedesaegypti和黑腹果蠅Drosophila melanogaster三種雙翅目昆蟲間,僅GSTd7和GSTe8存在明顯的1∶1∶1直系同源關(guān)系[16]。相反,非昆蟲特異家族的直系同源基因較容易鑒定,而且這些直系同源基因的相似性往往較高。這是因為非昆蟲特異家族在一些保守的生理學(xué)途徑中起著持家基因的功能,因而在物種的分化形成后,為保持其生理功能經(jīng)歷著約束性進化。因此,昆蟲特異的Delta和Epsilon家族在昆蟲適應(yīng)特殊生境中起著重要作用,而非持家基因的功能。Claudianos等[17]研究發(fā)現(xiàn)蜜蜂基因組中僅有1個Delta基因,推測這可能是蜜蜂對殺蟲劑非常敏感的主要原因之一。

表1 幾種模式昆蟲GST基因數(shù)目的比較

圖1 昆蟲GST s的進化模式圖

Delta和Epsilon家族GSTs在昆蟲基因組中顯示出了呈簇分布的特征(圖2)。岡比亞按蚊Delta基因位于第2號染色體的18B和19D區(qū),Epsilon呈簇分布于3R的33B[14];果蠅的11個Delta成員則位于3R的87B,而10個Epsilon位于2R的55C,另外4個基因散布于2R染色體[14,18];家蠶Delta成員與其他幾個物種一樣呈cluster分布,但是8個Epsilon基因中,僅3個基因呈串聯(lián)分布,其他的5個Epsilon基因則分布在不同的染色體上。因此,Epsilon GSTs在家蠶種內(nèi)特異擴增的機制有別于其他昆蟲。果蠅Epsilon基因簇中,物理距離的遠近能反映基因間的相似性和進化關(guān)系,表明該基因簇由單個基因而非基因區(qū)段重復(fù)而來,并且在重復(fù)后沒有基因重排現(xiàn)象發(fā)生[18]。其他幾個物種的Epsilon基因簇部分基因也有類似現(xiàn)象。但是按蚊和伊蚊均有8個Epsilon基因,僅有少量的一對一的直系同源關(guān)系,表明兩物種Epsilon基因簇中發(fā)生了局部的基因重復(fù)。

圖2 昆蟲Delta和Epsion GSTs的基因組分布[14-16]

比較基因?qū)W分析發(fā)現(xiàn),岡比亞按蚊、埃及伊蚊及家蠶Bombyx mori基因組中均發(fā)現(xiàn)不能劃分到已知家族的unclassified GST s,其在進化上與Delta和Epsilon關(guān)系較近(圖1)。Lumjuan等[16]將伊蚊的3個unclassified GST基因在大腸桿菌Escherichia coli中進行原核表達,由于GSTI1和GSTX1以包涵體形式表達,且復(fù)性也不能獲得活性蛋白,因此主要對GSTX2進行了親和純化和酶活性鑒定。發(fā)現(xiàn)GSTX2與血紅素有較強的親和力,因此該基因可能在保護伊蚊在吸血過程中免受血紅素毒害起重要作用,這實際也表現(xiàn)為適應(yīng)特殊生境的有利進化。按蚊和家蠶的unclassified GST s的功能及是否在適應(yīng)特殊生境起重要作用等還有待進一步的研究。

2 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與昆蟲抗藥性

昆蟲抗藥性研究由來以久,早在1914年,Melander就報道了美國梨圓盾蚧Aspidiotus perniciosus對石硫合劑能產(chǎn)生抗性[19]。隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)及基因組學(xué)的發(fā)展,昆蟲抗藥性研究取得了可喜進展。昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性的機制主要包括表皮穿透率下降、作用靶標敏感性降低和解毒代謝作用增強等三個方面,其中解毒代謝作用增強是昆蟲抗藥性的主要機制[20]。昆蟲體內(nèi)參與殺蟲劑解毒代謝的酶類主要包括細胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450-dependent monooxygenases,P450s)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶(carboxylesterases,COEs)三大超基因家族。GSTs是非常重要的一類解毒酶,它與昆蟲對有機磷、有機氯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)。

2.1 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與昆蟲有機磷抗性

有機磷殺蟲劑由于其廣譜性、低毒性和在環(huán)境中易被降解等特點,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的防治。GSTs在昆蟲有機磷抗性形成中起到了重要作用,它主要通過O-脫烷基作用(O-dealkylation)和O-脫芳基作用而解毒。如GSTs能催化谷胱甘肽與殺蟲威軛合,致使結(jié)構(gòu)中的一個O-甲基從殺蟲劑上脫落,從而降低殺蟲劑毒性[21-22];對硫磷和甲基對氧磷則是通過GSTs催化谷胱甘肽(glutathione,GSH)與殺蟲劑的“離去基團”(leaving group)軛合而解毒[23]。在實際應(yīng)用中,大量的有機磷殺蟲劑常以硫代磷酸酯形式使用,當其進入昆蟲體內(nèi)P450s能將毒性較低的硫代磷酸酯氧化為毒性較高的有機磷,從而達到殺蟲的目的,GSTs常作為次級代謝酶對這些高毒的硫代磷酸酯氧化物進行解毒[24]。

GSTs參與有機磷抗藥性形成的研究主要集中家蠅Malus domestica和小菜蛾P(guān)lutella xylostella兩個物種。而且這些研究相對較早,近些年GSTs參與OPs抗性形成的研究并不多見。由于呂敏等[8]對該研究進行了綜述,在此不一一贅述。迄今為止,小菜蛾P(guān) xGSTe1是目前已研究較為清楚的參與有機磷抗性的基因之一,該基因外源表達蛋白具有降解對硫磷(parathion)、甲基對硫磷(methylparathion)和對氧磷(paraoxon)的活性[25];而MdGSTd3和MdGS T-6A則是家蠅對甲基對硫磷和/或二嗪磷抗性的重要基因[26-27]。

2.2 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與昆蟲的有機氯抗性

GSTs與昆蟲有機氯抗性關(guān)系的研究主要集中在雙翅目昆蟲的果蠅、岡比亞按蚊和埃及伊蚊三個物種。早期研究發(fā)現(xiàn)DmGSTd1和AgGSTe2是果蠅和岡比亞按蚊重要的DDT抗性基因[28-29]。隨著岡比亞按蚊基因組的測序完成已及基因芯片技術(shù)的日益完善,David等[30]設(shè)計了“按蚊解毒芯片”(Anopheles detox chip),其中包括GSTs、P450s、COEs、氧化還原相關(guān)酶及對照基因共計230條探針,利用該芯片對DDT抗性和敏感品系的抗性相關(guān)基因進行表達差異研究,發(fā)現(xiàn)抗性品系A(chǔ)gGS Te2表達量是敏感系的3.88倍,及2個P450s和2個過氧化物酶在抗性品系中顯著表達上調(diào)。結(jié)果表明,多基因參與形成了岡比亞按蚊對DDT的抗性。與以前研究一致的是,DDT抗性基因AgGSTe2在“按蚊解毒芯片”中也被篩選鑒定為抗性基因。因此,在基因組水平,采用基因芯片技術(shù)篩選抗藥性候選基因是抗藥性研究行之有效的方法。通過該方法可為后續(xù)功能鑒定提供目標基因,這將大大縮短抗藥性基因的鑒定時間。

埃及伊蚊是DDT抗性研究的另一模式昆蟲,Grant等(1991)根據(jù)生化和免疫學(xué)方法在抗性GG品系中鑒定出GST-1a和GST-2(AaGSTD1)兩個過量表達的GST s同功酶,在不同發(fā)育階段及性別原因,抗性品系GST-1a的表達量是敏感品系的2～5倍,而AaGSTd1則是25～50倍[31]。AaGSTd1的過量表達可能由于敏感品系中AaGS Td1基因的5'側(cè)翼區(qū)存在一個抑制子,在抗性品系中該抑制子發(fā)生了功能缺失突變,從而導(dǎo)致AaGS Td1基因在抗性品系中過量表達[32]。但是在抗DDT和氯菊酯的品系PMD-R中,AaGSTd1基因并沒有過量表達[33],而是AgGSTe2的直系同源基因AaGSTe2存在過量表達,且外源表達也證實了AaGSTe2具有DDT ase和GPx的活性。因此,AaGS Td1和AaGS Te2均是伊蚊的DDT抗性基因,但在不同的抗性材料中行使解毒功能。

2.3 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與昆蟲的擬除蟲菊酯抗性

擬除蟲菊酯類殺蟲劑因其高效、廣譜、低毒(對人畜毒性低)和低殘留等優(yōu)點常被用作衛(wèi)生殺蟲劑和農(nóng)林害蟲的防治,但它致命的弱點是相對于有機磷和有機氯農(nóng)藥而言,昆蟲的抗性發(fā)展迅速。1997年,王開運等[34]將棉鈴蟲在室內(nèi)飼養(yǎng)和用藥篩選,氰戊聚酯篩選15代后,抗性達到了311倍,但用甲基對硫磷和辛硫磷分別篩選14代和13代后,抗性僅分別達到3.5倍和5.2倍。Abdullah等[35]用氯氰菊酯對甜菜夜蛾連續(xù)篩選12代,LC50達到8 625 mg/L,而沒有施藥的種群為90 mg/L,篩選后的抗性是篩選前的95.83倍。盡管昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性發(fā)展迅速,但是在實際中仍被廣泛使用。

2001年,Kostaropoulos等[36]通過酶的體外抑制試驗,發(fā)現(xiàn)溴氰菊脂(decamethrin)是GSTs活性(CDNB)的競爭性抑制劑,它能與GSTs的活性中心結(jié)合,從而揭示了GSTs能與擬除蟲菊酯分子結(jié)合,從而保護生物大分子免受損傷。擬除蟲菊酯抗性品系中,過量表達的GSTs能被動隔離擬除蟲菊酯分子,以增強昆蟲抗藥性。另外,擬除蟲菊酯殺蟲劑除了具有神經(jīng)毒性外,還可誘導(dǎo)昆蟲的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。Vontas等[37]克隆獲得了抗擬除蟲菊酯的褐飛虱品系中上調(diào)表達的NlGSTd1基因,體外表達研究表明該基因具有過氧化物酶活性。因此,GST s既可隔離擬除蟲菊酯,也可對擬除蟲菊酯引起的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物解毒,從而增強昆蟲對擬除蟲菊酯的抗性。

目前,GSTs與擬除蟲菊酯抗性關(guān)系的研究是3大類殺蟲劑中最為活躍的領(lǐng)域。埃及伊蚊的實驗室敏感品系經(jīng)溴氰菊酯deltamethrin連續(xù)汰選20代后,非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和生化測定結(jié)果表明抗性品系中的GSTs對模式底物CDNB的活性提高了1.11倍,證實GSTs在埃及伊蚊對溴氰菊酯抗性發(fā)生中起著重要作用[38]。在實驗室條件下,Hunt等[39]對莫桑比克南部的擬除蟲菊酯抗性不吉按蚊A.funestus以0.1%的高效氟氯氰菊酯lambdacyhalothrin汰選3代后,發(fā)現(xiàn)篩選后的GSTs活性顯著高于未篩選群體,表明GST s與不吉按蚊的高效氟氯氰菊酯抗性相關(guān)。

2005年,David等[30]利用“按蚊解毒芯片”比較了氯菊酯抗性和敏感品系間抗藥性相關(guān)基因的表達,表明AgGS Te2在抗性品系RSP中的表達量是敏感系的2.36倍。大規(guī)模的20k MMC1芯片及小尺度的“按蚊解毒芯片”對斯氏按蚊A.stephensi擬除蟲菊酯抗性(DUB-R)和敏感(BEECH)品系間的基因表達研究發(fā)現(xiàn),AsGST1-2是解毒相關(guān)基因中表達變化最大的基因,該基因在DUB-R中過量表達[40]。由于Sigma GSTs對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物有較高的親和性[41],斯氏按蚊AsGS T1-2可能具有過氧化物酶活性,從而對脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物解毒的功能。Strode等[42]以含有204個特異70 mer探針的”伊蚊解毒芯片”(Aedes Detox Chip),對氯菊酯抗性和敏感品系成蟲期的抗藥性相關(guān)基因的表達進行了研究,發(fā)現(xiàn)AaGSTe2和AaGSTe7在抗性品系PMD-R中過量表達,而抗性IM品系中AaGSTe2,AaGSTe3,AaGSTe4為過量表達基因,在兩份抗性材料中均發(fā)現(xiàn)了AaGS Te2過量表達。

3 展望

近十年來,在分子水平上研究GST s參與昆蟲抗藥性獲得了前所未有的進展。但是美中不足的是,已鑒定的抗藥性基因的表達調(diào)控機制研究仍相當匱乏。陳鳳菊和高希武(2005)對昆蟲GST s的表達調(diào)控機制進行了綜述[10],但是已有的多數(shù)研究的順式、反式調(diào)控機制還處于推測階段,有待實驗證實。由于GST s在藥物代謝中起著重要作用,哺乳動物GSTs基因的表達調(diào)控機制研究較為深入,已經(jīng)鑒定出了多種調(diào)控元件,例如異生物素反應(yīng)元件、NF-kB抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件和親電子反應(yīng)元件等[43]。哺乳動物GST s的調(diào)控機制研究為昆蟲的相關(guān)研究提供了有用參考。昆蟲抗藥性已成為世界性難題,害蟲防治還有待合理利用這些殺蟲劑重要靶標。因此,進一步闡明昆蟲GST基因的調(diào)控機制仍是昆蟲抗藥性研究的重要課題。

數(shù)種昆蟲的基因組測序完成及基因芯片技術(shù)的迅速發(fā)展和普遍應(yīng)用,為快速篩選殺蟲劑誘導(dǎo)以及在抗藥性昆蟲中過量表達的候選基因提供了便利?？顾幮院蜻x基因的獲得可用于后續(xù)的功能鑒定,這必將大大縮短抗藥性基因的鑒定時間。但由于殺蟲劑對昆蟲的選擇往往會同時產(chǎn)生多種抗性機制,如靶標抗性和代謝抗性等。就代謝抗性而言,也存在點突變導(dǎo)致的酶活性增加及過量表達兩種機制?；蛐酒夹g(shù)僅能篩選抗性和敏感品系間差異表達的基因,因此在抗藥性研究中如僅以基因芯片來鎖定抗藥性基因是不全面的,還需對靶標抗性及利用遺傳定位等方法進行研究。總體而言,抗藥性相關(guān)基因的過量表達是抗性的主要機制,基因芯片技術(shù)將在抗藥性基因的鑒定中得到更廣泛的應(yīng)用。

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