胡海 李濤 代方銀* 夏定國, 趙巧玲* 魯成

(1.西南大學蠶學與系統(tǒng)生物學研究所,生物技術學院重慶400716;2.中國農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所鎮(zhèn)江212018)

家蠶有豐富的突變類型,其中油蠶突變更是獨具特色。油蠶的形態(tài)特征是:幼蟲皮膚呈現(xiàn)透明或者半透明狀,像油紙一般。根據(jù)油蠶的透明度,可將油蠶分為高度油蠶、中度油蠶和低度油蠶。已知引起油蠶性狀的突變基因有40個左右[1-9]。

中國農科院蠶業(yè)研究所趙巧玲等[3]在蠶品種東3291的選育過程中發(fā)現(xiàn)了一種油蠶自然突變體,命名為jc油蠶(ojc),經(jīng)過連鎖分析ojc基因與紅卵(re)基因連鎖,屬于家蠶第5連鎖群,但基因位點未確定。2008年,jc油蠶移送西南大學家蠶基因庫進行鑒定,并為定位該突變基因著手培育三隱性系。我們在對jc油蠶的連鎖群采用標記基因pe(桃紅眼白卵)進行驗證的基礎上,用該連鎖群上與jc油蠶透明度相當?shù)慕痣u龍油蠶(ok)進行了雜交鑒定,現(xiàn)將結果簡報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

jc油蠶:油蠶自然突變,中國農科院蠶業(yè)研究所提供。

桃紅眼白卵(pe):漿液膜色素橙黃色,成蟲復眼淡紅色;金雞龍油蠶(ok):家蠶第5連鎖群油蠶突變,幼蟲皮膚高度透明;白帶黑翅(wb):成蟲翅的基部和外緣黑褐色,中間有白帶。為西南大學家蠶基因庫保存的遺傳材料。

1.2 方法

ojc與ok雜交,根據(jù)F1、F2表型分析兩種油蠶的遺傳關系。

ojc與pe雜交,F2代單蛾區(qū)分白卵與黑卵單獨收蟻飼養(yǎng),調查蛾區(qū)內分離情況,確定ojc與pe是否連鎖,同時配制ojc與pe的雙隱性材料;ojc與wb雜交,配制二者的雙隱性材料;在兩個雙隱性材料基礎上進行雜交,同樣方法獲得pe、wb、ojc的三隱性系。具體流程參照代方銀等[10](2007)發(fā)表論文中圖1、2所示方案。

同時進行ojc與ok致死率調查,初步了解二者在基因作用上的異同。

2 結果與分析

2.1 ojc油蠶與pe的連鎖分析

趙巧玲等用re對ojc進行了連鎖分析,本次實驗又選擇了第5連鎖群的桃紅眼白卵(pe)對ojc所屬連鎖群進行了再次驗證。用pe與ojc雜交,F2代單蛾區(qū)分白卵和黑卵飼養(yǎng),壯蠶期調查油蠶和正常蠶的分離比,結果飼養(yǎng)的3個蛾區(qū)中白卵部分都沒有發(fā)現(xiàn)油蠶。由于家蠶雌完全連鎖,在ojc和pe連鎖的情況下,在雜交F2代中不會出現(xiàn)既是pe白卵又是ojc油蠶的個體,而是按照黑卵正常蠶∶黑卵油蠶∶白卵正常蠶=2∶1∶1的模式分離,本實驗結果與之相符(3齡調查結果見表1);如果ojc和pe是獨立遺傳關系,則雜交F2應出現(xiàn)黑卵正常蠶∶黑卵油蠶∶白卵正常蠶∶白卵油蠶=9∶3∶3∶1,結果不然。據(jù)此我們判斷ojc與pe連鎖。這一結果與之前的報道[3]一致。

表1 (ojc×pe)F2性狀分離

2.2 jc油蠶與ok油蠶的雜交結果

家蠶第5連鎖群上的油蠶基因有oc、ok和otm。趙巧玲等[3]對oc與ojc的雜交試驗已確定這兩個基因位于不同的基因座上;otm為斑油蠶,而且透明度低,與jc油蠶的性狀相差甚遠。而ok油蠶與ojc同樣為高度油蠶,但是二者間沒有經(jīng)過遺傳實驗鑒定。2009年我們對ok和ojc進行了正反雜交試驗,結果雜交F1代全部為油蠶,油蠶性與親本一致,F2代亦沒有出現(xiàn)性狀分離,表型與親本和F1代一致,這一結果說明ok和ojc是同一基因座的突變。

2.3 jc油蠶與ok油蠶致死性調查結果

分別單蛾區(qū)飼養(yǎng)jc油蠶與ok油蠶各10蛾,同時飼養(yǎng)正常型蠶品種大造作為對照。各齡期死亡情況在餉食后第2d調查,蟻蠶頭數(shù)通過對孵化后的卵殼計數(shù)得到。調查發(fā)現(xiàn)各齡期大都在眠期出現(xiàn)死蠶,其中jc油蠶1齡眠中平均死亡率9.41%,其它齡期極少出現(xiàn)死蠶(表2);ok油蠶1齡眠中平均死亡率15.04%,2眠和3眠極少死蠶,4眠時平均死亡率高于jc油蠶,為9.61%(表3)。大造對照區(qū)1眠中死亡率2.22%(只調查了1蛾區(qū)蠶卵的幼蟲),其它齡期均沒有死蠶,可能僅是由于收蟻過程中損傷蟻蠶導致的死亡。

表2 jc油蠶幼蟲各齡期死亡率調查

表3 ok油蠶幼蟲各齡期死亡率調查

2.4 jc油蠶與pe、wb的三隱性系的培育

在進行ojc油蠶與pe連鎖驗證的同時,我們還選擇了家蠶第5連鎖群的wb突變開展了ojc油蠶與pe以及wb三隱性系的培育工作。從分白卵和黑卵飼養(yǎng)的pe和ojc雜交F2代中,黑卵部分選留油蠶個體與白卵部分雜交,從白卵部分選擇油蠶個體自交保種,便可得到pe-ojc雙隱性系。pe-wb雙隱性系的培育方法與此同。在作成了pe-ojc和pe-wb兩個雙隱性系統(tǒng)之后,因兩系統(tǒng)中pe已經(jīng)純合,我們再將這兩個材料雜交,用同樣的方法育成ojc和wb兩個基因的雙隱性系統(tǒng),便育成了pe、wb、ojc的三隱性系。

利用家蠶雌完全連鎖規(guī)律,兩個基因間雜交F2代的基因型只有8種,以pe、ojc為例,其中表現(xiàn)白卵性狀的有pe+/pe+和pe+/pe ojc兩種基因型;表現(xiàn)油蠶性狀的有+ojc/+ojc和pe ojc+/ojc兩種基因型,而只有pe+/peojc和pe ojc/+ojc兩種基因型的個體自交或者測交,才會出現(xiàn)既是白卵又是油蠶(pe pe/ojcojc)的后代,但這兩種基因型是由交換型配子組成的,因此這兩種基因型的個體較少,所以要適當放大飼養(yǎng)群體才有可能得到peojc/peojc的雙隱性純合體。

3 小結與討論

通過對jc油蠶進行連鎖群驗證、與ok油蠶進行雜交,結果表明jc油蠶與ok基因處于同一個基因座位。jc油蠶幼蟲皮膚透明度與ok油蠶皮膚透明度相當,為高度油蠶。兩種油蠶幼蟲都具有一定致死性,且主要是眠中死亡,較之ok油蠶,jc油蠶幼蟲致死率低一些。

家蠶突變基因的發(fā)掘和研究是重要的基礎工作。而新突變基因的鑒定和定位需要豐富的遺傳突變資源和定位標記體系作支撐。不同研究者對遺傳材料的辨認亦存在差異。ok油蠶為高度油蠶[2],本試驗中兩種油蠶相比油蠶性接近,皮膚透明度均高,因此,本研究認為jc油蠶亦為高度油蠶。本試驗jc油蠶的致死率較之前報[3]的數(shù)據(jù)低,分析其原因可能是兩次實驗使用的資源系統(tǒng)遺傳背景存在差別,以及環(huán)境因素導致的死亡率不同。本研究調查的材料是經(jīng)過與大造雜交后的油蠶純合系,遺傳背景與前報實驗材料不同。

根據(jù)本實驗結果,jc油蠶與ok油蠶的雜交沒有性狀分離,而初步調查結果顯示在幼蟲致死率上存在一定差異,初步判斷為等位點突變,故將ojc基因符號修改為okc,基因座5-4.7。所培育的三隱性材料也記為pe-wb-okc。但就現(xiàn)有的研究結果,還不能完全排除jc油蠶與ok為重復突變的可能,有待通過分子水平上的研究最終作出判定。

[1]向仲懷主編.家蠶遺傳育種學[M].北京:農業(yè)出版社,1994:24-31.

[2]向仲懷主編.蠶絲生物學[M].北京:中國林業(yè)出版社,2005:375-394.

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