賈玉臣，陳慶森*

乳源酪蛋白糖巨肽改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的研究

賈玉臣，陳慶森*

(天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

利用惡唑酮復(fù)制小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)以研究乳源酪蛋白糖巨肽(CGMP)對潰瘍性結(jié)腸炎的影響。空白對照組小鼠僅飼喂普通鼠食，模型對照組與3個CGMP組灌注惡唑酮誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎，誘導(dǎo)建模后對3個CGMP組小鼠分別灌胃低、中、高劑量的CGMP(劑量分別為5、50、500mg/(kg bw·d))，連續(xù)灌胃5d。期間記錄小鼠每天體質(zhì)量變化，末次灌胃后檢測小鼠血清中二胺氧化酶(DAO)活性以及結(jié)腸中髓過氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量，并觀察結(jié)腸組織形態(tài)。結(jié)果表明：低、中、高劑量CGMP均可在一定程度上改善惡唑酮誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎病癥，尤其以中劑量CGMP的作用較為明顯，因此證實CGMP作為一種營養(yǎng)手段調(diào)理潰瘍性結(jié)腸炎具有很好的前景。

酪蛋白糖巨肽；CGMP；惡唑酮；潰瘍性結(jié)腸炎

Delfour 等[1]于1965年在乳κ-酪蛋白中發(fā)現(xiàn)了含有唾液酸的多肽。牛乳中的κ-酪蛋白在凝乳酶作用下，105位Phe至106位Met之間的肽鍵斷裂，分成兩部分：不溶性的副酪蛋白(肽鏈的1～105部分)和可溶性的親水多肽(肽鏈的1 0 6～1 6 9部分，稱為酪蛋白巨肽，caseinomacropeptide，簡稱為CMP)。其中，有30%～50%的CMP是以糖基化的形式存在的，稱為酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide，CGMP)。因CGMP特殊的氨基酸組成，即不含芳香族氨基酸，在280nm波長處沒有紫外吸收，所以，它可作為苯丙酮酸尿癥(PKU)患者的膳食首選。此外，CGMP還有諸多其他的生物活性，比如抗微生物毒素[2]、促益生菌增殖[3]以及免疫調(diào)節(jié)[4]等活性，目前已有許多研究陸續(xù)地對CGMP的免疫調(diào)節(jié)作用進行了初步探索[5]，但國內(nèi)關(guān)于其調(diào)

理、改善和治療潰瘍性結(jié)腸炎(UC)病癥的研究還未見相關(guān)報道。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是指腸道的一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(crohn s disease，CD)。其中潰瘍性結(jié)腸炎因其病因未明，傳統(tǒng)藥物療效不甚理想，至今還沒有理想的治療方法[6]，開發(fā)一種有效的營養(yǎng)治療方案一直是該領(lǐng)域的研究熱點。本研究應(yīng)用惡唑酮(OXZ)復(fù)制UC模型，初步研究CGMP對OXZ誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的治療效果，從CGMP對模型小鼠的體質(zhì)量、結(jié)腸炎的3項氧化損傷指標、大體形態(tài)損傷評分以及病理組織形態(tài)的影響這4個方面進行對CGMP在腸道中的抗炎活性進行探討，以揭示CGMP可能在一定程度上調(diào)理或改善UC病癥效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Balb/c小鼠(SPF級，雄性，體質(zhì)量(25±2)g)、小鼠常規(guī)飼料購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

CGMP 新西蘭Tatua公司；惡唑酮 Sigma公司；二胺氧化酶(DAO)檢測試劑盒、髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木精染液、伊紅染液 天津市久圣醫(yī)療電子儀器有限公司；中性樹膠和切片用軟、硬石蠟 上海標本模型廠；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；石蠟切片機、生物組織攤片機、生物組織烤片機 金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠；倒置顯微鏡 日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

Balb/c小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，每組8只，隨機分為5組：正常對照組、模型對照組、低劑量CGMP組(5mg/(kg bw·d))、中劑量CGMP組(50mg/(kg bw·d))和高劑量CGMP組(500mg/(kg bw·d))。

1.2.2 UC模型制作[7]

禁食不禁水24h后，將硅膠管從肛門插入模型對照組、低劑量CGMP組、中劑量CGMP組和高劑量CGMP組小鼠腸道深約4cm注射，正常對照組組灌注50%乙醇作為對照，模型組與3個CGMP組均灌注1%OXZ(OXZ溶于50%乙醇)，灌腸后對3個CGMP組小鼠灌胃相應(yīng)劑量的CGMP，正常對照組與模型組僅飼喂普通鼠食，此記為第1天處理，連續(xù)灌胃5d。

1.2.3 觀察指標

每天觀察小鼠狀態(tài)(精神、活動、飲食量等)，測定所有小鼠的體質(zhì)量變化情況，并作詳細記錄。

1.2.4 血清中DAO活性的檢測

末次灌胃后對所有小鼠進行眼眶靜脈取血，分離血清，利用DAO試劑盒測定小鼠血清中DAO活性，具體操作依據(jù)試劑盒說明書進行。

1.2.5 大體形態(tài)損傷評分及結(jié)腸組織中MPO活性和MDA含量的測定

頸椎脫臼法處死所有小鼠，打開腹腔，剪取結(jié)腸段，對明顯病變處進行大體形態(tài)損傷評分，評分標準如表1所示[8]。

表1 大體形態(tài)損傷評分表Table 1 Criteria for evaluation of visible lesions in mouse colon

將結(jié)腸置于預(yù)冷處理的玻璃組織勻漿器內(nèi)制得5%結(jié)腸組織勻漿，利用MPO試劑盒和MDA試劑盒分別測定小鼠結(jié)腸中MPO的活性和MDA的含量，具體操作依據(jù)試劑盒說明書。同時取1cm病變結(jié)腸于4%甲醛中固定24h，先經(jīng)梯度濃度的乙醇脫水處理，二甲苯透明后，石蠟包埋，將已固定好的組織石蠟塊切成5μm切片，貼于防脫載玻片上經(jīng)展片、烤片處理，然后脫蠟復(fù)水，蘇木精染色15min，1%鹽酸分化15s并脫水后，置于伊紅染液中染色2min，中性樹膠封片后以供病理組織學(xué)觀察。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)利用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析，處理結(jié)果用平均值±標準差(x±s)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 CGMP對小鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量變化的影響

實驗期間，OXZ模型小鼠明顯表現(xiàn)為食量減少，毛發(fā)松散、無光澤，少動且有不同程度的腹瀉，肛部黏連；而正常對照組小鼠表現(xiàn)為飲食正常，毛發(fā)有光澤， 3個CGMP組的小鼠除前2d有腹瀉反應(yīng)外，與正常對照組相比其飲食差異不大。CGMP對3組小鼠體質(zhì)量變化的影響結(jié)果見表2。

表2 CGMP對小鼠體質(zhì)量變化的影響及其與對照組的比較(n=8)Table 2 Effect of CGMP on body weight of mice (n=8)

由表2可見，正常對照組小鼠在實驗期間體質(zhì)量明顯增加，而OXZ模型小鼠的體質(zhì)量一直呈現(xiàn)下降趨勢，從第4天開始體質(zhì)量下降超過了10%，兩組之間的差異極其顯著；低劑量和中劑量CGMP組小鼠在灌注OXZ兩天內(nèi)也呈現(xiàn)體質(zhì)量下降趨勢，且與正常對照組相比差異極其顯著，但下降幅度比OXZ模型組小鼠較小，而且第4天和第5天開始出現(xiàn)體質(zhì)量增加，與OXZ模型組差異極其顯著。高劑量CGMP組小鼠的體質(zhì)量一直呈下降趨勢，雖然期間一直與正常對照組差異極其顯著，但下降幅度比OXZ模型對照組小鼠小。

2.2 CGMP對小鼠MPO活力、MDA含量及DAO活力的影響

MPO活力、MDA含量及DAO活力可以準確反應(yīng)結(jié)腸的氧化損傷程度，本研究中CGMP對小鼠MPO活力、MDA含量及DAO活力的影響見表3。

表3 CGMP對小鼠DAO活力、MPO活力及MDA含量的影響(n=8)Table 3 Effect of CGMP on DAO and MPO activities and MDA content in mice (n=8)

由表3可見，OXZ模型組小鼠血清中的DAO活力與正常對照組差異極其顯著，低劑量CGMP組差異不顯著，中、高劑量CGMP組均比模型組顯著降低，與正常對照組差異不顯著；OXZ模型組小鼠結(jié)腸中的MPO活力與正常對照組之間差異極其顯著，低、中、高劑量CGMP組比OXZ模型組顯著降低，但與正常對照組存在著差異；模型組結(jié)腸中MDA含量比正常對照組顯著升高，中劑量CGMP可顯著降低MDA含量，且與正常對照組差異不顯著，低、高劑量CGMP組與正常對照組和模型組均無顯著性差異。

2.3 CGMP對小鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分的影響

根據(jù)結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分可以直接反映結(jié)腸的潰瘍程度，CGMP對小鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分的影響見表4。

表4 CGMP對小鼠結(jié)腸大體形態(tài)損傷評分的影響(n=8)Table 4 Effect of CGMP on visible lesions in mice colon (n=8)

由表4可見，OXZ灌腸形成結(jié)腸炎后模型組小鼠的結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)比正常對照組顯著增高，低、中、高劑量CGMP均可顯著降低小鼠結(jié)腸的大體形態(tài)損傷指數(shù)，但與正常對照組還存在著一定的差異。

2.4 CGMP對改善UC模型小鼠結(jié)腸組織形態(tài)觀察結(jié)果各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)經(jīng)放大40倍后的觀察結(jié)果見

圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸病理組織切片(×40)Fig.1 Histological images of mice from 5 groups (HE Staining,×40)

各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)經(jīng)放大100倍后的觀察結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸病理組織切片(×100)Fig.2 Histological images of mice from 5 groups (HE Staining,×100)

通過光鏡下小鼠結(jié)腸組織形態(tài)的照片(40倍和100倍)可以看出，正常對照組小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰，上皮完整，杯狀細胞豐富，而模型組小鼠結(jié)腸壁明顯增厚，固有

層水腫，杯狀細胞丟失。低、中、高劑量C G M P組小鼠結(jié)腸與模型組相比，上皮較完整，與正常對照組相比，腸壁稍厚。

3 討論與結(jié)論

近年來，本實驗室以努力提高原料乳的附加值和綜合利用水平為宗旨，利用不同技術(shù)手段成功地從乳中分離純化出CGMP，并建立起了相應(yīng)的成熟工藝路線[9-10]，為實現(xiàn)CGMP以及相關(guān)生物活性產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化打下了堅實的基礎(chǔ)。目前，國內(nèi)外有關(guān)CGMP的生物學(xué)活性以及功能特性有所報道，而CGMP與IBD相關(guān)的生物學(xué)功能報道較少，國內(nèi)未見報道。本研究以IBD動物模型為對象，探索CGMP對OXZ誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的治療效果，該動物模型對研究利用OXZ誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型具有以下優(yōu)點[7]：1)制模簡單，重復(fù)性好；2)模型動物易得，耗費較低；3)模型的組織學(xué)特征和炎癥分布均類似人類UC，可作為研究UC發(fā)病機制的有益工具；4)炎癥可持續(xù)2周左右可用于藥物療效的評估。雖然UC的發(fā)病原因至今尚不明確，但氧化損傷已被證實是其發(fā)病的一個重要機制，結(jié)腸組織的氧化損傷主要是由于氧自由基引起的。DAO是腸黏膜上層絨毛中具有高度活性的細胞內(nèi)酶，在組胺和多胺代謝中起作用，能夠反映腸道機械屏障的完整性和損傷程度。MPO是一種由中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞分泌的酶，與腸組織的氧化損傷呈典型的正相關(guān)[11]。MDA是脂過氧化反應(yīng)的一種重要產(chǎn)物，可反映機體內(nèi)自由基的積累，從而可以表征組織的氧化損傷。DAO、MPO與MDA可用來作為IBD病情活動臨床監(jiān)測指標。本實驗結(jié)果表明，OXZ模型對照組小鼠的氧化損傷指標(DAO活力、MPO活力及MDA含量)均比正常對照組顯著升高，可見潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織具有顯著氧化損傷；實驗中，低劑量CGMP可顯著降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的MPO活力(P＜0.01)，中劑量CGMP可顯著降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAO活力、MPO活力及MDA含量(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.05)，同時高劑量CGMP可顯著降低潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAO活力和MPO活力(P＜0.05，P＜0.01)，由此可以得出結(jié)論，CGMP可通過在腸道中發(fā)揮抗炎活性來減輕潰瘍性結(jié)腸炎的病征。IBD發(fā)病時，腸黏膜屏障被破壞，而改善腸黏膜的屏障功能是治療IBD的一大目標[12]，腸黏膜上皮細胞相互連接是腸黏膜屏障的重要組成部分。本實驗從實驗動物結(jié)腸病理組織形態(tài)的研究結(jié)果還證實了CGMP可保持較完整的上皮細胞，從而有助于維持結(jié)腸組織形態(tài)的完整。灌胃低、中、高劑量CGMP在有效模型期內(nèi)均可在一定程度上改善OXZ誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，尤其以中劑量CGMP的作用較為明顯。由于OXZ誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎在短期內(nèi)便可呈現(xiàn)最大病態(tài)，因此CGMP相對于藥物治療是作為一種營養(yǎng)方案使小鼠的炎癥在一定程度上加以改善。

有關(guān)IBD的發(fā)病機制的大量研究報道已證實是結(jié)腸組織的氧化損傷，本研究也證實CGMP對結(jié)腸組織的氧化損傷具有一定的改善和治療作用。近期IBD的發(fā)病機制已有從細胞因子、轉(zhuǎn)錄因子、腸道菌群等方面研究的報道，特別是CGMP對小鼠IBD改善、緩解、治愈的作用機制的研究。陳佳婕等[13]研究認為IBD患者腸黏膜免疫反應(yīng)異常，NF-κB是參與調(diào)控腸道免疫炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因子之一?，F(xiàn)已證明，許多IBD臨床治療用藥，如5-氨基水楊酸(5-ASA)、糖皮質(zhì)激素、抑制性細胞因子等的藥理作用均與抑制NF-κB有關(guān)[14]。到目前為止，國內(nèi)也有研究證實了P38MAPK信號傳導(dǎo)通路在結(jié)腸炎中的作用，并為UC的治療新藥提供實驗依據(jù)[15]。國外Requena 等[5]已經(jīng)證實了CGMP具有激活NF-κB信號通路的作用，并認為bovine casein glycomacropeptide (BGMP)在腸道中可能起到抗炎的作用。

總之，本研究可以證實CGMP對OXZ誘導(dǎo)的小鼠UC具有顯著的改善和治療結(jié)腸組織氧化損傷的功能，研究結(jié)論提示乳源的生物活性肽是解決IBD常見、難愈疾病的一條可行的途徑。但CGMP的科學(xué)明確的抗炎活性機制還有待于后續(xù)從分子水平上研究解決。

[1]DELFOUR A, JOLLES J, ALAIS C, et al. Caseino-glycopeptides: Characterization of a methionin residue and of the N-terminal sequence [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1965, 19: 452-455.

[2]OH S, WOROBO R W, KIM B, et al. Detection of cholera toxinbinding activity of κ-casein macropeptide and optimization of its production by the response surface methodology[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2000, 64: 516-522.

[3]曹晉宜, 陳慶森. 酪蛋白糖巨肽(CGMP)對小鼠盲腸中微生物區(qū)系的影響[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(10): 582-585.

[4]OTAIN H, HATA I. Inhibition of proliferative responses of mouse spleen lymphocytes and rabbit Peyer s patch ceils by bovine milk caseins and their digests[J]. Journal of Dairy Research, 1995, 62(2): 339-348.

[5]REQUENA P, DADDAOUA A, GUADIX E, et al. Bovine glycomacropeptide induces cytokine production in human monocytes through the stimulation of the MAPK and the NF-kappa B signal transduction pathways[J]. British Journal of Pharmacology, 2009, 157(7): 1232-1240.

[6]YOUNG Y, ABREU M T. Advances in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J]. Current Gastroenterol Reports, 2006,8(6): 470-477.

[7]王姮, 歐陽欽, 羅文杰. 惡唑酮結(jié)腸炎小鼠模型的建立[J]. 胃腸病學(xué), 2004, 9(2): 77-80.

[8]BUTZNER J D, PARMAR R, BELL C J, et al. Butyrate enema therapy stimulates mucosal repair in experimental colitis in the rat[J]. Gut, 1996, 38(4): 568-573.

[9]陳緒卓, 陳慶森. 甜乳清粉中酪蛋白糖聚肽(CGMP)的分離及刺激小鼠腸道分泌IgA特性的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(6): 327-331.

[10]李博智, 閆亞麗, 陳慶森. 利用TGase結(jié)合微濾技術(shù)從乳清粉中分離純化CGMP的研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(20): 94-100.

[11]SAIKI T. Myeloperoxidase concentrations in the stool as a new parameter of inflammatory bowel disease[J]. The Kurume Medical Journal, 1998, 45(1): 69-73.

[12]BRUEWER M, LUEGERING A, KUCHARZIK T, et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosisindependent mechanisms[J]. Journal of Immunology, 2003, 171(11): 6164-6172.

[13]陳佳婕, 鐘良. 抑制NF-κB激活途徑治療IBD的進展[J]. 國際消化病雜志, 2009, 29(2): 65-67.

[14]DIJKSTRA G, MOSHAGE H, JANSEN P L. Blockade of NF-κB activation and donation of nitric oxide : new treatment options in inflammatory bowel disease[J]. Scandinavian Journal of Gastroenterology, 2002, 236(Suppl1): 37-41.

[15]彭蘭. P38MAPK抑制劑SB203580對DSS結(jié)腸炎的影響[D]. 成都:四川大學(xué), 2005.

Improvement of Oxazolone-induced Ulcerative Colitis in Mice by Bovine Casein Glycomacropeptide

JIA Yu-chen， CHEN Qing-sen*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In order to explore the effect of casein glycomacropeptide (CGMP) on xazolone-induced ulcerative colitis in mice, the control group was fed regular diet, while the model group and three treatment groups were administered CGMP at three doses of 5, 50 mg/(kg bw·d) and 500 mg/(kg bw·d) by oral gavage for 5 days after oxazolone challenge. The change of body weight was daily recorded and diamine oxidase (DAO) activity in serum, myeloperoxidase (MPO) activity, malonaldehyde (MDA) content in colon, and histological change of colon were determined after the last administration. Treatments with the three doses of CGMP showed improvement on oxazolone-induced ulcerative colitis, while the dose of 50 mg/(kg bw·d) CGMP seemed to be better. In conclusion, CGMP holds promising potential to be applied in a nutritional therapy for the treatment of ulcerative colitis.

casein glycomacropeptide；CGMP；oxazolone；ulcerative colitis

TS201.2

A

1002-6630(2010)21-0365-04

2010-07-17

國家自然科學(xué)基金項目(30771524)

賈玉臣(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、乳品質(zhì)量與安全。E-mail：jychtotti@163.com

*通信作者：陳慶森(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為發(fā)酵生物技術(shù)、蛋白資源開發(fā)與應(yīng)用。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn