陳佳，宋建新

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染科，武漢430030

在研究細(xì)菌過程中，與細(xì)菌群體活動(dòng)密切相關(guān)的信號(hào)系統(tǒng)——群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，具有重要意義。細(xì)菌合成并釋放信號(hào)分子，胞外信號(hào)分子濃度隨細(xì)菌密度的增加而增加，達(dá)到閾濃度后能啟動(dòng)菌體中相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)菌生物行為，適應(yīng)環(huán)境變化[1]。細(xì)菌利用QS 系統(tǒng)相互交流，以群體的形式改變菌群的生物學(xué)特性，從而達(dá)到整個(gè)菌群最適合的生存狀態(tài)。同樣，在研究白假絲酵母〔又稱白念珠菌(CandidaAlbicans)〕過程中，具有相似交流作用的信號(hào)分子——法呢醇(farnesol)及其對(duì)應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，讓人類對(duì)真菌的認(rèn)識(shí)發(fā)生了較大改變[2]。進(jìn)一步研究表明，這種相互交流并非局限于種群內(nèi)部。共存于各種環(huán)境的細(xì)菌與真菌間存在復(fù)雜的相互關(guān)系，既有競爭、拮抗作用，也有協(xié)同、互助作用。如混合生物膜(biofilm)中的細(xì)菌與真菌相互競爭黏附位點(diǎn)，同時(shí)口腔細(xì)菌通過為白念珠菌提供黏附位點(diǎn)而幫助其定植。于是，有人將細(xì)菌與真菌間的這種關(guān)系定義為跨界相互作用(cross-kingdom interaction)[3]。

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和白念珠菌這兩種可共存于人體的條件致病菌，其相互作用很早就引起了人們的注意[4-6]。早期研究認(rèn)為，銅綠假單胞菌具有抗白念珠菌作用。如Gupta等通過分析燒傷患者傷口的病原菌類型，發(fā)現(xiàn)感染銅綠假單胞菌的傷口合并白念珠菌感染的概率明顯低于對(duì)照組，因而認(rèn)為銅綠假單胞菌抑制白念珠菌生長[7,8]。而近期研究表明，白念珠菌的存在同樣可制約銅綠假單胞菌的致病性[9]。綜合現(xiàn)有研究，兩者間的跨界相互作用也并非簡單的競爭、拮抗。本文將從幾種可能的機(jī)制探討銅綠假單胞菌與白念珠菌的跨界相互作用及其臨床意義。

1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

銅綠假單胞菌和白念珠菌均存在信號(hào)分子和對(duì)應(yīng)的QS系統(tǒng)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌至少存在3套密度感應(yīng)系統(tǒng)：以N-3-氧代十二烷酰-L-同型絲氨酸內(nèi)酯﹝N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL﹞為信號(hào)分子的Las系統(tǒng)、以N-丁?；?L-同型絲氨酸內(nèi)酯(N-butyryl-L-homoserine lactone，C4-HSL)為信號(hào)分子的Rhl系統(tǒng)和以2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮為信號(hào)分子的喹諾酮信號(hào) (pseusomonas qinolone signal，PQS) 系統(tǒng)。Las包括LasR (一種正向轉(zhuǎn)錄激活蛋白)和LasI〔催化血漿纖溶酶原激活物抑制物(plasminogen activitor inhibitor 1，PAI-1)合成〕；Rhl包括RhlR和RhlI(催化PAI -2合成)。LasR和Rh1R協(xié)調(diào)銅綠假單胞菌多種毒力因子的轉(zhuǎn)錄，如彈性蛋白酶、溶血素、除鐵色素、超氧化物歧化酶、堿性蛋白酶、殼多糖酶等[10]。PQS連接Las和Rhl系統(tǒng)，一方面Las和Rhl控制PQS生成，另一方面PQS又影響Las和Rhl的基因表達(dá)，兩者存在微妙的平衡關(guān)系。此外，PQS還在調(diào)整細(xì)菌密度、釋放毒力因子綠膿素等方面起一定作用[11]。

目前學(xué)者一致認(rèn)為，白念珠菌這一雙相菌，通過分泌信號(hào)分子——法呢醇來調(diào)節(jié)基因表達(dá)、形態(tài)改變和毒力變化，即存在以法呢醇為信號(hào)分子的QS系統(tǒng)。法呢醇，這一12碳原子的倍半萜烯，不僅是一種致病因子，還可抑制白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換和生物膜形成。Cao等通過cDNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)，使用法尼醇抑制白念珠菌生物膜形成時(shí)伴有274個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生改變，其中包括有關(guān)細(xì)胞壁蛋白、菌絲生長(形態(tài)轉(zhuǎn)換)、外排泵及熱休克蛋白的基因[12]。據(jù)推測，法呢醇對(duì)生物膜的抑制作用是通過組氨酸激酶(CHK1)的表達(dá)或激活來實(shí)現(xiàn)的[13]。

最新研究表明，白念珠菌的信號(hào)分子法呢醇和銅綠假單胞菌的信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL不僅在自身QS系統(tǒng)中發(fā)揮作用，還可改變對(duì)方的生物學(xué)行為，具體作用如下。

1.1 3-oxo-C12-HSL對(duì)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的抑制作用

當(dāng)共同培養(yǎng)白念珠菌與銅綠假單胞菌時(shí)，即便生長于誘導(dǎo)假菌絲形成的環(huán)境中，白念珠菌仍以酵母形態(tài)存在，無法完成形態(tài)轉(zhuǎn)換。進(jìn)一步研究表明，銅綠假單胞菌分泌的信號(hào)分子3-oxo-C12-HSL抑制白念珠菌酵母細(xì)胞的絲化，使其無法形成假菌絲[14,15]。Hogan等研究發(fā)現(xiàn)，200 μmol/L的3-oxo-C12-HSL即可完全抑制白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換。相反，將不能分泌3-oxo-C12-HSL的銅綠假單胞菌突變株與白念珠菌共同培養(yǎng)時(shí)，后者形態(tài)轉(zhuǎn)換并未受影響[14]。

白念珠菌從酵母形態(tài)轉(zhuǎn)換為菌絲形態(tài)在其黏附中起至關(guān)重要的作用，而黏附于組織是白念珠菌最終定植并致病的前提條件。相關(guān)研究表明，菌絲形態(tài)生長的白念珠菌具有更強(qiáng)的黏附性和侵襲性，也具有更強(qiáng)的致病性[16]。銅綠假單胞菌對(duì)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的抑制，必將影響其黏附和定植，最終削弱其致病性。這也提示，廣泛寄居于人體各部位的白念珠菌之所以呈酵母相，一定程度上歸因于其他共存的微生物對(duì)其形態(tài)轉(zhuǎn)換的抑制。而腸道菌群的平衡狀態(tài)，與這種跨界制約作用有著密切的關(guān)系。本課題組初步研究表明，改變銅綠假單胞菌pvdQ基因(具有長鏈高絲氨酸內(nèi)酯水解作用)表達(dá)，可影響銅綠假單胞菌對(duì)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的抑制作用。

1.2 法呢醇對(duì)PQS的抑制作用

Cugini等[9]將法呢醇加入銅綠假單胞菌的培養(yǎng)基15 min后，通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)和實(shí)時(shí)PCR等方法觀察到，編碼PQS的相關(guān)基因pqsA表達(dá)下調(diào)，以及序貫發(fā)生PQS分子減少和綠膿素產(chǎn)量降低。綠膿素是銅綠假單胞菌較為重要的毒力因子。體外研究已證實(shí)，綠膿素具有鈍化過氧化氫酶等各種酶、廣泛損傷細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及改變機(jī)體免疫反應(yīng)等作用[17]。法呢醇對(duì)PQS的抑制作用導(dǎo)致綠膿素減少，必將影響銅綠假單胞菌的致病性。

1.3 法呢醇對(duì)叢集運(yùn)動(dòng)的抑制作用

叢集運(yùn)動(dòng)(swarming motility)是銅綠假單胞菌的3種運(yùn)動(dòng)形式之一，也是細(xì)菌應(yīng)對(duì)黏稠環(huán)境的復(fù)雜適應(yīng)過程。Overhage等[18]應(yīng)用DNA微陣列實(shí)驗(yàn)觀察到，在促叢集運(yùn)動(dòng)條件下，大量毒力相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，故推斷叢集運(yùn)動(dòng)與銅綠假單胞菌的致病性有著密切關(guān)系。

McAlester等[15]研究表明，法呢醇有降低銅綠假單胞菌叢集運(yùn)動(dòng)的能力。目前已證實(shí)，鼠李糖脂(銅綠假單胞菌的一種致病因子)以生物表面活化劑的方式調(diào)節(jié)叢集運(yùn)動(dòng)，而鼠李糖脂的表達(dá)受PQS的調(diào)控。不難假設(shè)，法呢醇對(duì)叢集運(yùn)動(dòng)的抑制與其對(duì)PQS的抑制作用有關(guān)。鑒于叢集運(yùn)動(dòng)與致病性的關(guān)系，法呢醇的這種抑制作用勢必影響銅綠假單胞菌的致病性。

綜上所述，銅綠假單胞菌與白念珠菌的跨界相互作用依賴于各自的信號(hào)分子。因此，推測白念珠菌和銅綠假單胞菌的各自信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可感知彼此的存在并作出相應(yīng)反應(yīng)，也就是說它們之間可能存在信號(hào)系統(tǒng)的跨界作用，而且這種跨界相互作用影響彼此的致病性。

2 生物膜

在絕大多數(shù)環(huán)境中，微生物都傾向于以生物膜的形式存在。白念珠菌和銅綠假單胞菌均可形成各自的生物膜，也可與其他細(xì)菌(或真菌)混合存在于同一生物膜中。在混合生物膜中，各微生物相互競爭附著點(diǎn)。白念珠菌的凝集素樣序列和細(xì)胞表面糖蛋白因牽涉到黏附于宿主表面的過程，通常在混合生物膜的形成中起重要作用。

體外研究證實(shí)，銅綠假單胞菌將從數(shù)量和質(zhì)量上抑制白念珠菌生物膜的形成[19]。亦有學(xué)者觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象，將白念珠菌與銅綠假單胞菌混合培養(yǎng)時(shí)，銅綠假單胞菌可在白念珠菌菌絲上形成致密的生物膜。幾乎在生物膜形成的同時(shí)，白念珠菌菌絲死亡，而對(duì)酵母細(xì)胞并無影響[20]。通過對(duì)一系列銅綠假單胞菌突變株的研究，Hogan等證實(shí)銅綠假單胞菌的某些毒力因子，包括菌毛和分泌的可溶性分子，參與殺菌絲的過程。隨后的研究表明，菌絲死亡涉及直接接觸和可溶性分子介導(dǎo)2種調(diào)控模式[21]。

El-Azizi等[22]通過直接計(jì)數(shù)生物膜中細(xì)菌或真菌數(shù)量的變化，研究其相互作用。發(fā)現(xiàn)將銅綠假單胞菌加入白念珠菌的成熟生物膜中，細(xì)菌數(shù)量顯著增加；相反，將白念珠菌加入銅綠假單胞菌的成熟生物膜中，真菌數(shù)量則不會(huì)增加。比較不同微生物對(duì)導(dǎo)尿管黏附能力的體外研究亦證實(shí)，白念珠菌的存在將增強(qiáng)銅綠假單胞菌對(duì)導(dǎo)尿管的黏附[23]。上述現(xiàn)象可能與白念珠菌的黏附能力和形成生物膜的能力強(qiáng)于銅綠假單胞菌有關(guān)。混合生物膜中白念珠菌并未對(duì)銅綠假單胞菌產(chǎn)生競爭、拮抗作用；相反，它增強(qiáng)銅綠假單胞菌的黏附能力，促進(jìn)其生物膜形成。

通過生物膜這一可能機(jī)制，銅綠假單胞菌發(fā)揮其對(duì)白念珠菌的殺菌絲作用，最終將限制白念珠菌的致病性；同時(shí)，白念珠菌對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成的協(xié)同作用，可能在一定程度上增強(qiáng)其致病性和耐藥性。

3 毒力因子

早在1973年，就有研究發(fā)現(xiàn)，含綠膿素的銅綠假單胞菌氯仿粗提物具有抗白念珠菌作用。后來Kerr等[24]通過高效液相層析儀分離細(xì)菌浸液(銅綠假單胞菌臨床分離株)，并經(jīng)紫外分光及質(zhì)譜分析驗(yàn)證，進(jìn)一步證明綠膿素這一氧化還原色素發(fā)揮主要的抗真菌作用，其機(jī)制為綠膿素降低白念珠菌菌絲轉(zhuǎn)換所依賴的胞內(nèi)cAMP量[25]。最新研究[26]表明，綠膿素的前體5-甲基-鹽酸異丙嗪-1-羧酸(5-MPCA)間接發(fā)揮抗真菌作用，因?yàn)?-MPCA相關(guān)紅色素與真菌活力下降有關(guān)，但綠膿素并非是其發(fā)揮抗真菌作用所必需的；這一5-MPCA衍生的紅色素在真菌胞內(nèi)聚集，并保留氧化還原的能力，因而推斷這種氧化還原能力與真菌毒力下降有關(guān)。總之，銅綠假單胞菌分泌的某些毒力因子參與其抗白念珠菌的過程。

以上所述3種機(jī)制并非各自獨(dú)立。已證實(shí)銅綠假單胞菌的某些毒力因子也參與菌絲表面生物膜形成和菌絲死亡過程。生物膜作為一種細(xì)菌群體、細(xì)菌間及細(xì)菌與環(huán)境間的信號(hào)傳遞，對(duì)生物膜的形成與成熟發(fā)揮重要作用?？傊?，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物膜、毒力因子共同作用于白念珠菌與銅綠假單胞菌的跨界相互作用，詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語

白念珠菌與銅綠假單胞菌均為條件致病菌。銅綠假單胞菌對(duì)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的抑制以及殺菌絲和毒力因子的毒性作用，可能很大程度限制白念珠菌的致病性。而白念珠菌對(duì)銅綠假單胞菌PQS的抑制作用，導(dǎo)致其毒力因子綠膿素產(chǎn)量下降以及叢集運(yùn)動(dòng)減退，也將削弱其致病性。正是因?yàn)閮烧叩目缃缦嗷プ饔?，相互制約而維持平衡，在一定條件下保證了各自的條件致病性。一旦這種平衡被打破，各自的致病性將會(huì)引起機(jī)體損害。銅綠假單胞菌和白念珠菌如何相互作用而影響彼此的致病性，具體機(jī)制還需要更深入研究。

臨床上，長期或大量使用抗生素?？蓪?dǎo)致真菌感染。這種繼發(fā)感染的發(fā)生機(jī)制很可能與本文提及的跨界相互作用有關(guān)，即細(xì)菌被殺滅后其對(duì)真菌的抑制作用也隨之消失。提示在對(duì)細(xì)菌感染性疾病的治療過程中應(yīng)充分重視跨界相互作用的存在，更合理使用抗菌藥物，從而避免激發(fā)真菌感染。同樣，在抗真菌治療時(shí)也應(yīng)考慮同時(shí)調(diào)整抗細(xì)菌藥物的使用，以修復(fù)細(xì)菌和真菌的平衡，降低繼發(fā)嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)。

跨界相互作用也為研究新藥提供了方向。如果能充分利用其相互制約致病性的特點(diǎn)，選擇合適靶點(diǎn)，將為治療帶來極大便利。

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