李習(xí)平，楊梓懿，石繼連，江星明

（1.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與檢驗系，湖南 岳陽 414000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

知母是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖。具有清熱瀉火、生津潤燥的功效，用于外感熱病，高熱煩渴，肺熱燥咳，骨蒸潮熱，內(nèi)熱消渴，腸燥便秘[1]。研究表明，芒果苷是其清熱作用的主要有效成分[2]。為了保證知母的臨床療效，我們采用正交設(shè)計法，以芒果苷的含量為考察指標(biāo)，對其水處理軟化工藝進行了優(yōu)選研究，為其飲片規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

LC-10ATVP型高效液相色譜儀 （日本島津）；N3000色譜軟件系統(tǒng)；SPD-10AVP型UV檢測器 （日本島津）；FE102型微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG101型 （鞏義市英峪予華儀器廠）；ISO9001型分析天平（南京庚辰科學(xué)儀器有限公司）。

芒果苷對照品 （成都普思生物科技有限公司提供，批號：PS08062501）；知母藥材購自湖南省邵東縣廉橋中藥材市場，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室周日寶教授鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 因素水平

以芒果苷為考察指標(biāo)，選擇加水量、浸泡溫度、浸泡時間和潤制時間等4個因素進行水處理工藝考察。各因素水平見表1。

表1 知母水處理軟化工藝因素水平表

2.2 水處理方法

取知母藥材，按L9（34）因素水平表，加一定量水，在一定的溫度下，浸泡一定的時間撈出，再潤制一定的時間后切制成厚度為2～4 mm的薄片，在80℃烘干。

2.3 芒果苷含量測定

2.3.1 色譜條件 Gemini5uC18110A 柱 （150 mm× 4.6 mm）；流動相：水∶乙腈∶0.85%磷酸（108∶18∶5）；流速：0.65 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：258 nm。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取一定量的芒果苷對照品，加甲醇制成0.177 mg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取經(jīng)“2.2”項下方法制備的知母飲片，分別過30目篩后精密稱取0.1 g，置50 mL具塞燒瓶中，加入50%乙醇25 mL，精密稱定。90℃水浴回流30 min，冷卻，用50%乙醇補重。濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，水浴揮干溶劑，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別精密吸取芒果苷對照品溶液0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mL，加甲醇定容至5 mL，在上述色譜條件下重復(fù)進樣2次，每次20 μL，測定峰面積。以峰面積平均值（A）和濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程為：

A=4 368 440 C+19 718，r=0.999 6

結(jié)果表明芒果苷在0.177～0.885 μg之間線性關(guān)系良好。見圖1。

圖1 芒果苷HPLC圖

2.3.5 精密度試驗 取對照品溶液，每次進樣20 μL，連續(xù)進樣6次，測定芒果苷吸收峰面積，計算RSD為1.82%。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、6、12、24 h進樣，測定芒果苷吸收峰面積，計算RSD值為1.24%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重現(xiàn)性試驗 精密稱取同一知母樣品粉末0.1 g，按“2.2.3”項下供試品溶液的制備方法平行制備5份，各進樣兩針，每次進樣20 μL，測定芒果苷的吸收峰面積，計算RSD為1.93%。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一知母樣品粉末0.05 g 6份，分別精密加入相當(dāng)于樣品中芒果苷含量80%、100%和120%的芒果苷對照品溶液，按供試品溶液處理，進行含量測定，計算芒果苷的平均回收率為（98.15±2.18）%，RSD為2.22%。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果

2.3.9 樣品的含量測定 取不同水處理軟化方法制備的供試品溶液，按上述色譜條件，進樣20 μL，測定峰面積，以干燥品計算含量。結(jié)果見圖2、表3。

圖2 芒果苷供試品HPLC圖

表3 知母水處理L9(34)正交試驗結(jié)果 （n=3）

2.4 方差分析

以SS值最小的A因素SS值作誤差，對正交設(shè)計實驗芒果苷含量的結(jié)果進行方差分析，4個因素對芒果苷的含量均無顯著性影響，經(jīng)綜合考慮實際情況，知母的最佳水處理軟化工藝為A1B3C1D1，即將知母藥材加 20倍水，在30℃下，浸泡時間0.5 h后撈出，潤制時間4 h。結(jié)果見表4。

表4 方差分析表

3 結(jié)論

3.1 色譜條件的確定

檢測波長258 nm是將芒果苷對照品溶液作全波長掃描及參考有關(guān)文獻[3]后確定的。流動相和流速經(jīng)多次預(yù)試后確定，理論塔板數(shù)大于3 000，拖尾因子為0.98，說明系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

3.2 因素水平

本實驗選擇考察加水量、浸泡溫度、浸泡時間及潤制時間等4個對水處理工藝影響較大的因素，經(jīng)單因素考察初步結(jié)果，結(jié)合傳統(tǒng)軟化方法的實際操作，確定了每個因素的水平。從實驗結(jié)果看來，各因素的考察水平有待于進一步細化。

3.3 芒果苷的提取方法

許多提取芒果苷的文獻[3-4]多為超聲提取，筆者曾用超聲法在同一超聲儀中提取制備供試品 （同時提取多個或多次分別提?。?，重現(xiàn)性和加樣回收率試驗結(jié)果RSD均大于5%，最后改用本實驗中的回流提取補重的方法，RSD均小于3%。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：148.

[2]鄧家剛，鄭作文，曾春暉.芒果苷的藥效學(xué)實驗研究[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2000，20(6)：802.

[3]周永剛，黃 晟，谷 莉，等.HPLC法測定知母藥材中芒果苷和新芒果苷的含量[J].藥學(xué)實踐雜志，2005，23(2)：99-102.

[4]宋 珅，陸兔林，季 德.正交法優(yōu)選光知母水處理工藝[J].中藥材，2007，30(3)：335-338.