童巧珍，周日寶，劉湘丹，盛孝邦，王朝暉

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南 長沙 410128；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

百合，作為藥用植物、觀賞植物和食物在中國的栽培已經(jīng)有很長一段歷史，其種質(zhì)資源豐富，常見有以下種或品種。

藥用百合有百合科植物卷丹 Lilium lancifolium Thunb.、百合L.brownii F.E.Brown var.viridulum Baker、細(xì)葉百合L.pumilum DC.的干燥肉質(zhì)鱗葉[1]；觀賞百合在商業(yè)花卉栽培學(xué)上其主要分為以下三大類型：一是東方百合 （Oriental hybrids）種群類型；二是亞洲百合 （Asiatic hybrids）種群類型；三是麝香百合（L.longiflorum）種群類型[2]。至今在切花栽培中仍負(fù)盛名的“康涅鍬格王子”就是卷丹、毛百合（L.dauricum Ker.Gawl）與荷蘭百合（L. enchantment）雜交所獲得的中世紀(jì)百合雜交種中的優(yōu)良品種，王百合（L.regale）、麝香百合亦為名貴切花[3]；食用百合主要有百合、卷丹、川百合（L.davidii Duch.）、山丹（L.pumilum DC.）、百合、毛百合及沙紫百合（L.sargentiae Wils.）。

中國作為中藥資源大國，盡管種質(zhì)資源豐富，但由于種種原因，一些野生資源遭到嚴(yán)重破壞。盡管自20世紀(jì)80年代以來我國對百合屬植物的研究己取得了一些初步成果，但從現(xiàn)有資料分析中可看出，有關(guān)百合的研究工作主要集中在分類學(xué)、繁殖及栽培生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、育種等4個方面，對其種質(zhì)資源描述評價方面卻少有涉及[4-5]。而對百合種質(zhì)資源及其親緣關(guān)系的研究，可為其栽培生產(chǎn)提供適宜的種類，為其育種提供豐富的種源，從而對百合產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有著重要意義。筆者利用RAPD技術(shù)對不同來源的百合種質(zhì)資源進(jìn)行了研究，其DNA提取及RAPD條件優(yōu)化方法均已作了報道[6-7]，現(xiàn)將其種質(zhì)資源間親緣關(guān)系及RAPD指紋圖譜分析方法與結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 百合種源概況

2005年7～11月從江蘇、江西、廣西、湖南、甘肅5?。▍^(qū)）采集16個百合種質(zhì)資源各10～16株（表1），種植于湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園內(nèi)，以備采集新鮮鱗葉和其他試驗(yàn)用。每一產(chǎn)地來源的百合樣品采集10株地下新鮮肉質(zhì)鱗葉，分別提取其DNA，然后按照等量方式將來自10株的DNA混合后，作為該地百合DNA的樣本，用于RAPD分析。

表1 百合樣品來源一覽表

1.2 DNA提取及RAPD擴(kuò)增反應(yīng)

參見文獻(xiàn)[6-8]中DNA提取及RAPD擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶賦值為“1”，同一位置無帶的賦值為“0”，由此生成“0”和“1”原始矩陣。統(tǒng)計每個引物擴(kuò)增處的總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)。數(shù)據(jù)采用NTSYS軟件進(jìn)行UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）聚類分析，建立樣品間的親緣關(guān)系聚類樹型圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA標(biāo)記引物篩選與PCR擴(kuò)增結(jié)果

本法提取的百合基因組DNA的樣品，測得其OD260/ OD280比值范圍為1.53～2.00，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，提取的基因組DNA為一條清晰完整明亮的帶，遷移率與λDNA相當(dāng)，沒有拖尾或彌散現(xiàn)象(圖1)。凝膠的點(diǎn)樣槽中未發(fā)現(xiàn)明顯的熒光信號。因而，該實(shí)驗(yàn)提取的DNA純度高，完全符合實(shí)驗(yàn)的要求，可用于進(jìn)一步進(jìn)行RAPD擴(kuò)增。

隨機(jī)用5號樣品對120條隨機(jī)引物進(jìn)行篩選，從中選出35條能獲得清晰譜帶、反應(yīng)穩(wěn)定、存在多態(tài)性和重復(fù)性好的引物用于PCR擴(kuò)增和群體遺傳變異的分析(表2，圖1)。

2.2 百合供試材料基因組的指紋圖譜分析

利用引物B2、G4、M14、B3對16份百合供試材料進(jìn)行RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖分析，得出各樣品相對應(yīng)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA指紋圖譜及指紋峰（表3）。結(jié)果表明指紋圖譜能反應(yīng)出樣品間差異，可為鑒別藥材提供分子水平指紋圖譜。圖2為11號樣品的DNA指紋圖譜，圖3為B2、G4、M14、B3擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜的三維圖譜。

圖1 引物M19擴(kuò)增結(jié)果圖

表2 百合種質(zhì)資源35條有效引物序列及其DNA片段數(shù)

表3 引物B2、G4、M14、B3對各樣品擴(kuò)增的指紋峰

圖2 引物B2、G4、M14、B3對樣品11擴(kuò)增的指紋圖譜

圖3 引物B2、G4、M14、B3擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜三維圖譜

2.3 百合供試材料的親緣關(guān)系及遺傳距離分析

RAPD擴(kuò)增結(jié)果表明，35條有效引物共擴(kuò)增出769條譜帶，其中多態(tài)帶有628條，多態(tài)性位點(diǎn)比率為81.7%，每條引物擴(kuò)增的帶數(shù)在11～36條之間，平均為22條。其中擴(kuò)增帶數(shù)最多的為B1引物，有36條擴(kuò)增帶，且不同的引物擴(kuò)增片段的數(shù)目及其多態(tài)性程度不同，表明供試材料具備豐富的遺傳多樣性。利用統(tǒng)計分析軟件將16份不同百合種質(zhì)資源的RAPD標(biāo)記進(jìn)行聚類分析(圖4)，參照表4列出的不同百合種質(zhì)資源間的遺傳距離可看出，16份樣品之間的遺傳距離為0～0.940 7。其中，樣品6與樣品7之間的遺傳距離最小達(dá)到0.008 9，兩者間親緣關(guān)系最近，為卷丹從江蘇省引種到湖南省龍山縣栽培過程中形成的2個農(nóng)家品系（尖頭系和平頭系）。樣品10與樣品11之間的遺傳距離最大為2.209 1，表明這兩個樣品間有較大的遺傳背景差異，它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，為百合科兩個近緣百合屬和大百合屬植物。

在聚類分析的基礎(chǔ)上，16份供試品以遺傳距離0.940 7為閾值可分為2個RAPD群（RAPD groups，簡稱RGs），即RG1和RG2。其中RG2為樣品10，而其他樣品為RG1。這為百合科的不同兩個屬，RG1為百合屬 （lilium），RG2為大百合屬（cardiocrinum）。

RG1在閾值為0.579 0處又被分為兩大亞群：第一大亞群包括樣品6、7、11、12，其余樣品為第二大亞群。第一大亞群在閾值為0.316 7處又被分為兩類：一類為6、7、12號樣品卷丹L.lancifolium Thunb.；第二類為11號樣品細(xì)葉百合L.pumilum DC.。第二大亞群在閾值為0.298 2樣品分為兩類，第一小類為野生種樣品4，除10號樣品外，其余為第二小類，均為栽培品種，說明同屬同種植物因?yàn)樯姝h(huán)境不同，存在著較大的遺傳差異。聚類結(jié)果與生長環(huán)境亦有趨異效應(yīng)，故第二小類同屬同種不同產(chǎn)地的百合存在較小的分類。以上聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)鑒別的結(jié)論一致，說明RAPD分析可以從分子水平上鑒定不同屬不同種不同遺傳背景的藥材，為中藥材百合種質(zhì)資源的研究和利用提供了一種新的方法。

表4 百合樣品間遺傳距離

圖4 基于RAPD標(biāo)記結(jié)果的實(shí)驗(yàn)材料聚類分析圖

3 討論

3.1 指紋圖譜及三維圖譜分析

應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)對RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖進(jìn)行分析可以得出以泳道中各譜帶的吸收度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)、譜帶位置Pix為橫坐標(biāo)的指紋圖譜及三維圖譜。從圖譜中可以看出不同樣品同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物指紋圖譜峰有相同位置，也存在不同位置，能體現(xiàn)不同樣品之間基因組序列存在的差異，說明不同樣品基因組序列中與引物互補(bǔ)的相同序列片斷位點(diǎn)不同。不同樣品同一譜帶位置峰峰高（吸收度值）不同，說明不同樣品基因組序列中與引物相互補(bǔ)的相同序列片斷數(shù)目不同。指紋圖譜和電泳圖譜都能說明樣品之間的遺傳背景差異，但指紋圖譜將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶的有無及條帶的強(qiáng)弱轉(zhuǎn)化為指紋峰形式，這可與化學(xué)指紋圖譜一起建立鑒別中藥材優(yōu)良種質(zhì)的多元鑒別體系，具有較大的研究意義。

3.2 遺傳距離和聚類分析

從分析結(jié)果可知不同屬百合之間遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，同屬百合之間遺傳距離相對較小，親緣關(guān)系較近，但屬內(nèi)不同種百合之間亦存在一定的遺傳距離，證明種內(nèi)亦存在遺傳差異；另同屬同種植物之間也存在一定的遺傳距離，這說明地域差異也會引起植物產(chǎn)生趨異效應(yīng)而具遺傳差異；野生種與經(jīng)過馴化的栽培品種在遺傳距離也較大，表明野生種與栽培種在遺傳背景上存在一定的差異；藥材具有明顯的地域性，地域上偏北或偏南的同屬同種植物之間遺傳距離相對較小，而地域偏北與偏南的同屬同種植物之間遺傳距離相對較大。

通過對16個樣品進(jìn)行ΜPGMA聚類分析得到樹狀圖表明所研究的百合品種分為兩大類群，繼而又將一些亞群明顯區(qū)分開來。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們經(jīng)驗(yàn)鑒定的結(jié)果一致，說明RAPD技術(shù)具有較高的分辨力，完全能夠?qū)⒃谛螒B(tài)、生藥性狀及化學(xué)成分等特征上具有高度相似性、來源一致或十分相近的藥材區(qū)別開來，可正確鑒別百合科不同屬及種間群體。而且對種內(nèi)等級亦能進(jìn)行有效的區(qū)別，為百合藥材的鑒定、百合不同品系的鑒定以及篩選優(yōu)良品系提供分子生物學(xué)依據(jù)。RAPD分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用，從居群和分子水平上闡明藥材道地性產(chǎn)生的生物學(xué)本質(zhì)成為可能，因而該方法可以作為不同中藥百合品系鑒定的依據(jù)，為中藥百合的鑒定提供了一種行之有效的分子水平方法。

[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2005:88.

[2]神農(nóng)氏.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:67.

[3]蘇 敬,李 績.唐本草[M].合肥:安徽科技出版社,1981:223-224.

[4]盧之頤.本草乘雅半偈[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1986:279-280.

[5]李時珍.本草綱目[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:1 680-1 682.

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[7]童巧珍，盛孝邦，劉湘丹，等.藥用百合DNA提取和RAPD條件的優(yōu)化[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008，28（2）：33-36.

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