趙蒙蒙，謝夢(mèng)洲，李路丹，何軍鋒，王 玉

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)2007級(jí)研究生班，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.山西特殊教育中等專業(yè)學(xué)校，山西 太原 030012）

鬼箭羽(Euonymus alatus)為衛(wèi)矛科(celatraceae)衛(wèi)矛屬植物衛(wèi)矛(Euonymus alatus（Thunb）Sicb)具翅狀物的枝條或翅狀附屬物，是一味傳統(tǒng)的中藥[1-2]，其氣微，味微苦澀，性寒，無毒，入厥陰、太陰經(jīng)。具有破血、通經(jīng)、殺蟲、散瘀止痛等功效。藥材中含槲皮素(Quercetin)、衛(wèi)矛醇(Dulcito1)等黃酮成分和甾類物質(zhì)[3]。近年來,臨床和實(shí)驗(yàn)研究均表明鬼箭羽對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥有很好的治療和預(yù)防作用，并有研究者認(rèn)為其能刺激β細(xì)胞加強(qiáng)胰島素的分泌[4]，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)鬼箭羽對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞的影響進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選擇清潔級(jí)SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):scxk(滬)2008-0016]。

1.1.2 藥物 鬼箭羽生藥購自湖南楚仁堂醫(yī)藥連鎖經(jīng)營(yíng)有限責(zé)任公司。鬼箭羽生藥飲片以水煎，常壓加熱揮發(fā)濃縮至3.0 g生藥/mL浸膏待用。優(yōu)降糖（格列苯脲）由天津太平洋制藥有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號(hào)：090112)。

1.1.3 試劑 鏈脲佐菌素（由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：112K10)購自長(zhǎng)沙科泰生物技術(shù)有限公司；小鼠insulin單克隆抗體 （武漢博士德生物工程有限公司提供,批號(hào)：0805）；即用型SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司提供，批號(hào)：09E02）。

1.1.4 儀器 血糖測(cè)試儀（超越JPS-5）、血糖試紙（批號(hào)：20100728）均由怡成生物電子技術(shù)有限公司提供；彩色圖像采集系統(tǒng)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 先將40只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白組7只，模型制備組33只。制備2型糖尿病模型。然后將成模大鼠隨機(jī)分為模型組、鬼箭羽組和優(yōu)降糖對(duì)照組。

1.2.2 模型制備及給藥方法 空白組大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，其余33只大鼠進(jìn)行2型糖尿病模型制備[5]，予高脂飼料喂飼(高脂飼料配方如下：豬油10%，膽固醇1%，膽酸0.3%，基礎(chǔ)飼料88.7%)，4周后，將大鼠禁食不禁水12 h，然后行腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，劑量：30 mg/kg體質(zhì)量（STZ以0.1 mol/L、pH4.4的檸檬酸鈉緩沖液配制）?？瞻讓?duì)照組以等量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。同時(shí)觀察大鼠一般狀況。第4天，對(duì)模型制備組大鼠禁食不禁水10 h，尾靜脈采血測(cè)空腹血糖，以空腹血糖＞10.0 mmol/L者為2型糖尿病造模成功。再將這些成為2型糖尿病模型的大鼠隨機(jī)分為模型組、鬼箭羽組和優(yōu)降糖對(duì)照組，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。鬼箭羽組：給予鬼箭羽2.25 g生藥/kg，優(yōu)降糖對(duì)照組：給予優(yōu)降糖0.85 mg/kg，模型組、空白對(duì)照組：給予等量生理鹽水灌胃，給藥劑量均按60 kg成人體表面積換算。給藥容量10 mL/kg體質(zhì)量，每日1次，連續(xù)給藥4周。末次給藥0.5 h后，所有大鼠禁食不禁水10 h，尾靜脈取血測(cè)空腹血糖，腹主動(dòng)脈采血后處死，留取胰腺組織，進(jìn)行胰島β細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 （HE染色，免疫組織化學(xué)染色）。

1.2.3 空腹血糖檢測(cè) 禁食不禁水10 h后，尾靜脈采血，按照血糖儀的說明進(jìn)行操作。HE染色檢測(cè)：胰腺組織常規(guī)石蠟切片，HE染色光鏡下觀察胰島，島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞膜完整性，細(xì)胞核的大小形態(tài)。免疫組化檢測(cè)：用免疫組化ABC法對(duì)已制備的胰腺組織石蠟切片進(jìn)行染色。以小鼠insulin單克隆抗體為Ⅰ抗顯示β細(xì)胞，顯微鏡觀察，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析胰島素染色陽性細(xì)胞的陽性程度，胰島素染色陽性細(xì)胞面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 造模后一般情況觀察

注射STZ后，有1只大鼠在造模過程中死亡，經(jīng)血糖檢測(cè)，有3只大鼠未達(dá)到2型糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)。成模大鼠均出現(xiàn)不同程度多飲、多尿，體質(zhì)量減輕，精神不振，捕捉時(shí)抵抗力減弱，體毛無光澤等異常。

2.2 鬼箭羽對(duì)2型糖尿病大鼠空腹血糖的影響

將大鼠禁食不禁水10 h后，測(cè)空腹血糖，結(jié)果顯示，模型組、鬼箭羽組、優(yōu)降糖組與空白組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），說明2型糖尿病模型成功。給藥4周后，模型組、鬼箭羽組、優(yōu)降糖組空腹血糖較給藥前均有所下降，其中以優(yōu)降糖組最為明顯，但與空白組相比，血糖仍然偏高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05或P＜0.01）；模型組血糖與鬼箭羽組、優(yōu)降糖組相比較，其差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 鬼箭羽對(duì)各組大鼠給藥前后血糖的影響 (mmol/L，±s)

表1 鬼箭羽對(duì)各組大鼠給藥前后血糖的影響 (mmol/L，±s)

注：與空白組比較▲▲P＜0.001；與模型組比較◆P＜0.05,◆◆P＜0.01。

組 別 n 藥物劑量 給藥前血糖 給藥后血糖7.60±0.57 18.62±4.75▲▲13.46±4.03▲▲◆11.87±3.72◆◆空白組模型組鬼箭羽組優(yōu)降糖組6899——2.25 g/kg 0.85 mg/kg 7.53±0.47 19.93±4.39▲▲18.42±5.03▲▲18.70±4.52▲▲

2.3 鬼箭羽對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞HE染色的影響

空白組，正常胰島呈圓形，胰島β細(xì)胞大小一致，核染色質(zhì)清晰，胞漿界線清楚，淡染細(xì)胞顆粒，細(xì)胞呈索狀排列；模型組的胰島β細(xì)胞排列稀疏不均，大部分細(xì)胞核淡染，細(xì)胞形態(tài)不一，溶界消失，胞漿出現(xiàn)空泡，不清晰；鬼箭羽組胰島β細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組正常胰島細(xì)胞比較，大致正常，胞漿略不均勻，核仁尚較清晰，細(xì)胞排列較均勻；優(yōu)降糖組胰島β細(xì)胞與正常組比較，細(xì)胞排列較稀疏不均，大部分細(xì)胞核淡染，溶界消失，胞漿出現(xiàn)空泡，較不清晰，但與模型組相比，細(xì)胞形態(tài)改變程度略低。見圖1。

圖1 鬼箭羽對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞的影響光鏡圖（HE染色觀察10×40）

2.4 鬼箭羽對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞免疫組化的影響

大鼠胰島內(nèi)染色陽性、細(xì)胞漿著棕色顆粒者即為β細(xì)胞。染色陽性區(qū)域面積大小代表胰島素表達(dá)量，如圖2所示。圖像分析采用Image-pro plus6.0系統(tǒng)。統(tǒng)計(jì)面積（area）、平均光密度（Density（mean））、累計(jì)光密度（IOD（sum））等形態(tài)學(xué)量化指標(biāo)。可以看出，模型組中陽性染色表達(dá)最低，各項(xiàng)指標(biāo)與空白組、鬼箭羽組、優(yōu)降糖組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與空白組比較，其陽性面積與鬼箭羽組、優(yōu)降糖組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白組平均光密度、累計(jì)光密度與鬼箭羽組、優(yōu)降糖組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；鬼箭羽組面積、平均光密度、累計(jì)光密度等指標(biāo)與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），鬼箭羽組與空白組陽性面積比較，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），鬼箭羽組平均光密度、累計(jì)光密度與空白組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 鬼箭羽對(duì)各組大鼠免疫組化相關(guān)指標(biāo)的影響 (±s)

表2 鬼箭羽對(duì)各組大鼠免疫組化相關(guān)指標(biāo)的影響 (±s)

注：與空白組比較▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與模型組比較★★P＜0.001；與優(yōu)降糖組比較▼▼P＜0.01。

組別空白組模型組鬼箭羽組優(yōu)降糖組IOD(sum)（×103）16.42±2.94 5.34±2.45▲▲13.29±3.63★★14.65±3.47★★n6899藥物劑量10 mL/kg 10 mL/kg 2.25 g/kg 0.85 mg/kg Area 107.6±20.48 48.96±11.54▲▲▼▼89.74±16.41▲★★90.95±11.24▲★★Density(mean) 169.79±28.61 107.38±26.32▲▲151.82±34.96★★160.96±31.74★★

圖2 鬼箭羽對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞的影響光鏡圖（免疫組化觀察10×40）

3 討論

鬼箭羽性味苦寒，中醫(yī)認(rèn)為苦寒能堅(jiān)陰清熱，且能入血，鬼箭羽擅于清解陰分之燥熱，對(duì)糖尿病之陰虛燥熱者頗為有效。有研究表明鬼箭羽中提取的草酰乙酸鈉通過刺激β細(xì)胞分泌胰島素,降低正常和糖尿病家兔的血糖[1],臨床實(shí)踐亦表明其對(duì)于糖尿病具有良好的治療作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鬼箭羽能夠降低2型糖尿病大鼠的血糖，但其降糖效果不及優(yōu)降糖；但是，病理切片進(jìn)行HE染色后，對(duì)大鼠胰島及胰島β細(xì)胞形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，鬼箭羽干預(yù)的大鼠胰島及胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)與模型組相比，改變程度較低。從免疫組化的結(jié)果看，鬼箭羽干預(yù)的大鼠各指標(biāo)都優(yōu)于模型組，說明鬼箭羽可以起到保護(hù)和刺激胰島β細(xì)胞的作用，優(yōu)降糖組大鼠胰島β細(xì)胞染色陽性程度也很高，是由于優(yōu)降糖能夠刺激胰島β細(xì)胞，增加胰島素的分泌，故而染色陽性程度高。綜合HE染色及免疫組化觀察到的形態(tài)學(xué)改變，研究發(fā)現(xiàn)鬼箭羽在降低血糖的同時(shí)，對(duì)胰島β細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

[1]趙國(guó)平,戴 慎,陳仁壽,等.中藥大辭典[M].上海:上?？萍汲霭嫔纾?006：1 695-1 696.

[2]謝宗萬,佘友琴.全國(guó)中草藥名鑒[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000：538.

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[4]胡劍秋,甄 艷.參芪麥味地黃湯重加鬼箭羽治療糖尿病[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志,2000，5(45):209-210.

[5]陳 秋，夏永鵬，邱宗蔭.2型糖尿病大鼠模型的建立與評(píng)價(jià)[J].天津醫(yī)藥,2006,1(34)：33-35.

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