王小娟，施花錦，郭建生，夏 歷

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌的主要致病因子，中醫(yī)中藥對(duì)H.pylori感染性胃炎的研究主要是臨床療效研究和體外抑菌研究，對(duì)其發(fā)病和作用機(jī)制研究較少。近年來有研究發(fā)現(xiàn)H.pylori感染與核因子-κB(NF-κB)有著密切的關(guān)系[1-2]，本實(shí)驗(yàn)通過建立H.pylori感染性胃炎的小鼠模型,觀察中藥復(fù)方滅幽湯的臨床療效,并重點(diǎn)研究該方治療胃黏膜炎癥的作用機(jī)制。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性昆明小鼠50只，體質(zhì)量 （25±5）g，由湖南省長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(湘)2006-0001。

1.1.2 藥物 滅幽湯（由黃芩、蒲公英、青皮、陳皮、三七、白及、烏賊骨組成）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供，將中藥浸泡30 min后用武火煎煮3次，再將湯汁熬成浸膏，高溫滅菌后保存?zhèn)溆?。三九胃泰顆粒由三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字0904012。

1.1.3 試劑 快速尿素酶試劑盒由福建三強(qiáng)生物化工有限公司生產(chǎn);免疫組化NF-κB一抗、二抗及SABC,購自武漢博士德生物有限公司。

1.1.4 儀器 石蠟切片機(jī)，調(diào)溫定時(shí)型電烤箱，分光光度計(jì)，凝膠成像分析系統(tǒng)，4BH-Z型光學(xué)雙筒顯微鏡，顯微鏡照相系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模 昆明小鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機(jī)分組：正常對(duì)照組10只，造模組40只。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用灌胃針灌50%的乙醇0.2 mL/只，1 h后灌胃給以H. pylori菌株(109CFU/mL，0.4 mL/只)；隔天灌胃1次，共5次,接種后第5天進(jìn)行快速尿激酶檢測(cè)，陽性者為造模成功[3]。將造模成功的小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組：滅幽湯高劑量組、滅幽湯低劑量組、三九胃泰組、模型組，每組10只。

1.2.2 給藥方法和劑量 滅幽湯高劑量和低劑量組分別為33.79 g/kg、11.26 g/kg灌服滅幽湯煎液（給藥劑量均按60 kg成人體表面積換算，分別相當(dāng)60 kg成人用量的4、2倍），正常組和模型組灌胃生理鹽水15 mL/kg每日灌胃1次，連續(xù)用藥2周。

1.2.3 H.pylori感染情況 快速尿素酶檢測(cè)陽性可判斷為H.pylori感染。

1.2.4 病理組織學(xué)檢測(cè) 采用HE染色法觀察小鼠胃黏膜炎癥程度，炎癥程度分級(jí)參照人胃炎的分類法，均屬于慢性淺表性胃炎,根據(jù)炎細(xì)胞的數(shù)量及浸潤(rùn)胃壁的深度分為3級(jí)并計(jì)分：無炎癥0分,輕度炎癥1分,中度炎癥2分,重度炎癥3分。

1.2.5 NF-κB的蛋白表達(dá) 采用免疫組化法檢測(cè) （操作方法參考相關(guān)試劑盒說明書）。采用病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，在高倍鏡下計(jì)算其平均光密度（OD）求其平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 滅幽湯對(duì)小鼠胃黏膜炎癥程度的影響

滅幽湯組H.pylori陽性率明顯低于模型組及三九胃泰組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；滅幽湯組胃黏膜炎癥程度低于模型組及三九胃泰組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 滅幽湯對(duì)各組小鼠胃黏膜炎癥程度的影響 （n=10）

2.2 滅幽湯對(duì)小鼠胃黏膜 NF-κB的蛋白表達(dá)的影響

正常組、滅幽湯高、低劑量組、三九胃泰組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；滅幽湯高、低劑量組與三九胃泰組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；三九胃泰組、滅幽湯高、低劑量組與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表2。

表2 滅幽湯對(duì)各組小鼠胃黏膜NF-κB蛋白表達(dá)的影響 （n=10，OD，±s）

表2 滅幽湯對(duì)各組小鼠胃黏膜NF-κB蛋白表達(dá)的影響 （n=10，OD，±s）

注：與模型組比較*P＜0.05；與三九胃泰組比較#P＜0.05；與正常組比較△P＞0.05。

組別正常組模型組三九胃泰組高劑量組低劑量組藥物劑量（g/kg）——0.128 0.034 0.026 NF-κB 0.090±0.049* 0.272±0.091 0.170±0.051△* 0.112±0.090△*# 0.127±0.071△*#

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn),H.pylori是引起慢性胃炎、消化性潰瘍和MALT淋巴瘤的主要病因,且被認(rèn)為是胃癌的Ⅰ級(jí)致癌因子。H.pylori本身及其定植后所引起的炎癥和免疫反應(yīng)是H.pylori造成胃黏膜損害的主要機(jī)制,NF-κB是一種作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子,通常以非活性狀態(tài)存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí),從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核,與特定基因啟動(dòng)區(qū)域上針對(duì)NF-κB的特定序列結(jié)合,調(diào)控特定基因如前炎癥介質(zhì)(如TNF-α,IL-1和IL-8)、黏附分子、趨化因子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP1)和IL-8和一些炎性相關(guān)酶類的過度或持續(xù)表達(dá),使大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于炎癥部位[4-5]。

清熱利濕法不僅對(duì)H.pylori有直接抑殺作用,而且還能通過調(diào)整機(jī)體全身和胃黏膜局部的屏障功能,以達(dá)到輔助抑殺并改變H.pylori寄居的微環(huán)境,使之不利H.pylori定居或繁殖,以達(dá)到治療H.pylori感染的目的[6]。滅幽湯是在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下組方而成，以清熱利濕，理氣和胃立法，方中黃芩、蒲公英清熱燥濕解毒為君，以除脾胃之濕熱；青皮、陳皮行肝脾氣滯以疏通氣機(jī)；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陳皮協(xié)調(diào)氣血之運(yùn)行，又收斂生肌修復(fù)局部之病灶；重用烏賊骨制酸止痛而為之使。研究表明：清熱解毒中藥能夠改善胃黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黃芩、蒲公英能抗多種病原微生物，對(duì)多種球菌和桿菌有殺滅作用；白及祛腐生肌可修復(fù)糜爛的胃黏膜；烏賊骨含有豐富碳酸鹽和磷酸鹽能改變胃的酸性內(nèi)環(huán)境，抑制H.pylori的生長(zhǎng)；三七活血化瘀止痛、消炎生肌，促進(jìn)血液循環(huán)消除組織水腫，促進(jìn)黏膜增生，加快修復(fù)，臨床研究顯示本方對(duì)HAG患者具有較好的療效。這些藥物直接或間接的抗炎作用可能是本方改善胃黏膜炎癥的基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,胃黏膜炎癥部位存在組織學(xué)的異常，炎癥細(xì)胞密度增加，NF-κB存在失活和活化兩種狀態(tài)，NF-κB活化表達(dá)與炎癥細(xì)胞密度呈正相關(guān),提示由NF-κB激發(fā)的黏膜炎癥反應(yīng),可能是影響炎癥程度的關(guān)鍵。而經(jīng)滅幽湯治療,胃黏膜炎癥部位NF-κB表達(dá)、炎癥細(xì)胞密度均顯著減低,組織學(xué)改善,說明滅幽湯能抑制NF-κB的活化和表達(dá),從而抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。可見，滅幽湯能減輕胃黏膜炎癥程度,降低NF-κB表達(dá)強(qiáng)度,說明滅幽湯可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能,增強(qiáng)胃黏膜屏障能力,抑制胃酸分泌,調(diào)節(jié)胃內(nèi)微環(huán)境,抑制H.pylori定植；改善胃黏膜血流,抑制致炎因子的產(chǎn)生,從而起到減輕胃黏膜炎癥,保護(hù)胃黏膜的作用;通過抑制H.pylori的定植,減少其產(chǎn)生的細(xì)胞毒素的刺激,減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,降低NF-κB高度表達(dá),從而發(fā)揮對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用。通過觀察H.pylori感染性胃炎的小鼠模型發(fā)現(xiàn),H.pylori感染后NF-κB的表達(dá)強(qiáng)度升高,抑殺H.pylori后可以有效的治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎，抑制NF-κB的激活可能是滅幽湯在幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的防治中發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制之一。

[1]胡伏蓮,周殿元.幽門螺桿菌感染的基礎(chǔ)與臨床[M].北京:中國科學(xué)出版社,2002:54.

[2]劉文忠.幽門螺桿菌研究進(jìn)展[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2001:66.

[3]張榮光，段廣才.幽門螺桿菌感染的昆明小鼠模型的建立[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（12）：857-859.

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[5]徐 藝，葉 柏，單兆偉，等.中草藥單味與復(fù)方對(duì)幽門螺桿菌抑菌作用研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志，2000，8（5）：292-293.

[6]戴高中.對(duì)中醫(yī)藥治療幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃腸病的思考[J].中醫(yī)雜志，2005，46（5)323-325.