邱昕,陳國(guó)華,馮佩,汪弢,梅瑰,王月古,邵衛(wèi),張忠文,潘宋斌

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,武漢430022

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的發(fā)病率急劇上升[1],現(xiàn)代研究證明,β淀粉蛋白(amyloid β,Aβ)的沉積在AD的病理生理過程中起重要作用,不僅對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生直接毒性,還可誘發(fā)腦內(nèi)一系列病理改變[2-4]。分子遺傳學(xué)研究顯示,多種AD相關(guān)基因中APP第一個(gè)被發(fā)現(xiàn),它是由定位于21號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的基因編碼的含有695～770個(gè)氨基酸殘基的跨膜蛋白。人類 APP基因含有 19個(gè)外顯子(exons 1～13,13a,14～18),AD患者腦內(nèi)老年斑的主要成分是由APP基因的16～17外顯子編碼的APP水解片段 Aβ肽[5]。抑制β-APP基因的表達(dá),能有效預(yù)防AD發(fā)生[6]。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動(dòng)物：3月齡SPF級(jí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠50只,體質(zhì)量(30±5)g,合格證號(hào)為2005674,由南京大學(xué)動(dòng)物模式所提供,飼養(yǎng)于SPF屏障實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室。②主要試劑與材料：黃連解毒湯(huanglian jiedu decoction,HLJDD)(由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供);鹽酸多奈哌齊(安理申,衛(wèi)材中國(guó)藥業(yè)有限公司生產(chǎn))5 mg/片,批號(hào)為 H20050978;Trizol試劑(購(gòu)于Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)于TOYOBO公司);其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;Mr23i臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(購(gòu)于HERAUS公司);實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)(realtime PCR detection system)(購(gòu)于 SLANHONGSHI公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 HLJDD由黃連、黃芩、黃柏和梔子組成,按處方配伍的生藥粉碎后用水提取,提取液過濾,濾液靜置,高速離心得到沉淀Ⅰ;濾液通過大孔吸附樹脂過濾,烯醇洗脫部分,真空濃縮干燥,得到固體Ⅱ。將沉淀Ⅰ與固體Ⅱ進(jìn)行均勻混合,得到有效部位,總得率為7.6%。分離分析顯示所得有效部位的化學(xué)成分主要為生物堿類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類。利用分光光度法分別測(cè)定生物堿類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類成分的含量,用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定其指標(biāo)性成分小檗堿、黃芩苷、梔子苷的含量。有效部位(群)的總含量＞55%,指標(biāo)性成分(群)的總含量＞25%。HLJDD與安理申給藥前均用 0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose,CMC)混懸。

1.2.2 分組及干預(yù) 50只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、安理申組、HLJDD大劑量組、HLJDD中劑量組、HLJDD小劑量組各10只。正常飼喂1周后,對(duì)照組給予0.5%CMC灌胃,安理申組給予安理申3 mg/(kg?d)混懸液灌胃,HLJDD大劑量組給予 HLJDD 865 mg/(kg?d)混懸液灌胃,HLJDD中劑量組給予HLJDD 433 mg/(kg?d)混懸液灌胃,HLJDD小劑量組給予HLJDD 216 mg/(kg?d)混懸液灌胃。每組均連續(xù)灌胃給藥6個(gè)月。如有小鼠死亡,隨機(jī)補(bǔ)足數(shù)量,并計(jì)算各組小鼠死亡率。

1.2.3 標(biāo)本制備 6、10月齡時(shí),每組各隨機(jī)抽取2只小鼠,10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉,在4℃冰袋上快速取腦,冷生理鹽水沖洗殘血,拭干,浸入預(yù)冷的4%多聚甲醛固定、包埋,海馬區(qū)冠狀切片,厚度4 μ m,于60℃烤箱內(nèi)烘烤2 h后備用。

1.2.4 HE染色 室溫30℃,切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟5 min,然后經(jīng)100%、95%、70%酒精梯度脫水各5 min,蘇木素染色5 min,水洗,1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,水沖洗回藍(lán),伊紅染色1 min后水洗,再由低到高濃度脫水透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)。

1.2.5 改良甲醇剛果紅染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水,蘇木素染5 min后水洗,1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒后溫水回藍(lán),水洗,甲醇剛果紅染色15 min,水洗后0.2%堿性乙醇分化數(shù)秒,水洗,常規(guī)脫水、透明、封片,正置光學(xué)顯微鏡下觀察,甲醇剛果紅陽(yáng)性斑塊為老年斑,于100倍視野下隨機(jī)選取3個(gè)視野,計(jì)數(shù)各組老年斑數(shù)量。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR 末次灌胃1 h后,斷頸處死小鼠,快速取出兩側(cè)海馬約50 mg放入研磨器,參照Trizol試劑說明書方法研磨20～30 min;將液體倒入滅菌后的EP管內(nèi),加三氯甲烷250 μ L,上下顛倒充分混勻,靜置5 min,4℃離心,13000 rpm×10 min;取上清液于另一滅菌EP管內(nèi),加入等量異丙醇,混勻放入4℃冰箱 15 min后取出,4 ℃離心,13000 rpm×10 min;傾倒出上方液體,加入75%的乙醇1 mL,4℃離心,7500 rpm×5 min;傾倒上部液體,只剩白色沉淀;瞬時(shí)離心,盡量吸干管內(nèi)液體,晾干,加入適量的去離子水溶解。內(nèi)參基因上游引物：M-actin-S 5'-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3',下游引物：M-actin-A 5'-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3';目的基因上游引物：M-APP-S 5'-TGGCGGTGAAGACAAAGTAGTAG-3',下游引物：M-APP-A5'-CTCAGTGGTGGTTGTGGTGG-3'。所用引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5;M-actin核酸序列號(hào)：NM_007393.2,引物BLAST 的 結(jié) 果 ：http ：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi;M-APP核酸序列號(hào)：NM_007471.2,引物 BLAST 的結(jié)果：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?？俁NA提取、變性后,配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 1 μ L,5 ×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μ L,dNTP 2 μ L,Oliga(dT)201 μ L,去 RNA 酶水 10 μ L,RNA酶抑制劑1 μ L,ReverTra Ace 1 μ L;反應(yīng)條件：42℃孵育20 min,95℃反應(yīng)5 min,4℃反應(yīng)5 min。配置PCR反應(yīng)液：SYBR Green mix 12.5 μ L,引物(5 pmoL/μ L)2 μ L,雙蒸水8 μ L,cDNA(1 ∶10)2.5 μ L;反應(yīng)條 件 ：50℃孵育2 min,95℃反應(yīng) 2 min后,經(jīng)95℃變性15 s,退火15 s,72℃延伸45 s,40個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。在循環(huán)過程中,通過實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)分析同時(shí)完成熒光檢測(cè)。以β-actin 為內(nèi)參照,按公式 β-APP/βactin計(jì)算β-APP mRNA水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(x-±s)表示,Fisher確切概率法、方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠死亡率比較 對(duì)照組、安理申組、HLJDD大劑量組、HLJDD中劑量組及HLJDD小劑量組分別死亡 3(30%)、4(40%)、1(10%)、1(10%)、1(10%)只,Fisher確切概率法分析顯示,各組死亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,推測(cè) HLJDD未對(duì)小鼠產(chǎn)生毒性致死作用,安全性較高。

2.2 HE染色結(jié)果 HE染色顯示,各組6月齡小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊,鮮見細(xì)胞空泡變性及壞死,各組間無明顯差別。10月齡,對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列紊亂,部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,大量細(xì)胞出現(xiàn)固縮壞死;HLJDD大劑量組、小劑量組與安理申組間差異不大,海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較整齊,少量細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性、固縮壞死;HLJDD中劑量組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊,部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,未見細(xì)胞壞死,見圖1A-C。

2.3 改良甲醇剛果紅染色結(jié)果 6月齡時(shí),僅對(duì)照組小鼠大腦皮質(zhì)可見少量橘紅色沉積物(老年斑),密度低,其余各組皮質(zhì)、海馬區(qū)均未見老年斑形成。10月齡,對(duì)照組小鼠皮質(zhì)、海馬區(qū)均可見大量老年斑沉積,面積增大。HLJDD大、中、小劑量組、安理申組及對(duì)照組老年斑數(shù)量分別為(3.0±0.5)個(gè),(3.0±0.7)個(gè),(6.0±0.8)個(gè),(5.0±0.6)及(14.0±1.5)個(gè),前4組均少于對(duì)照組(P＜0.05),見圖2A-C。

2.4 β-APP基因mRNA水平檢測(cè)結(jié)果 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示,對(duì)照組、安理申組、HLJDD大劑量組、HLJDD中劑量組的β-APP mRNA的水平分別為(1.3308±0.0404)、(1.2852 ±0.0336)、(1.2714 ±0.0125)、(1.2604 ±0.0214)、(1.2918 ±0.0184),安理申組和HLJDD小劑量組低于對(duì)照組(P＜0.05),HLJDD大劑量組和中劑量組顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);HLJDD大劑量組低于安理申組(P＜0.05),HLJDD中劑量組顯著低于安理申組(P＜0.01),HLJDD小劑量組高于安理申組(P＜0.05);HLJDD大小劑量組均高于 HLJDD中劑量組(P＜0.05),HLJDD大、小劑量組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

AD是起病隱襲、進(jìn)行性發(fā)展的癡呆,是老年人最常見的神經(jīng)退行性疾病,其腦部主要的病理學(xué)特征為老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)形成和神經(jīng)元丟失等。目前研究普遍認(rèn)為Aβ是老年斑的主要成分,大量Aβ聚集或沉積會(huì)形成老年斑,其周圍局灶性炎癥反應(yīng)和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,使得Aβ和炎性細(xì)胞因子構(gòu)成毒性環(huán)路,不斷損傷神經(jīng)細(xì)胞,最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性變[7]。Aβ的這種神經(jīng)毒性作用,屬于中醫(yī)“毒”的范疇,有學(xué)者認(rèn)為[8],“毒損腦絡(luò)”在AD的發(fā)病中有重要作用,Aβ是“毒損腦絡(luò)”機(jī)制中的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。對(duì)于AD患者,經(jīng)典的治療方法主要針對(duì)其腦內(nèi)膽堿能遞質(zhì)作用不足,采用以鹽酸酸多奈哌齊為代表的膽堿酯酶抑制劑,改善AD患者的認(rèn)知功能缺損,但這些藥物會(huì)引起受體下調(diào)和脫敏,其長(zhǎng)期使用的療效并不理想。

HLJDD源于唐代王燾《外臺(tái)秘要》,由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味苦寒藥物組成,是清熱解毒方中的經(jīng)典方劑。該方由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成。方解認(rèn)為該方集黃連、黃芩、黃柏、梔子大苦大寒之品于一方之中,以黃連瀉心火為君,兼瀉中焦之火;臣以黃芩清肺熱,瀉上焦之火;佐以黃柏瀉下焦之火;使以梔子清瀉三焦之火,導(dǎo)熱下行;具有清熱解毒之功效,正恰和AD“毒損腦絡(luò)”的病機(jī)。方青等[9]發(fā)現(xiàn),HLJDD能提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,其可能機(jī)制為調(diào)整AD大鼠的免疫功能和增加抗炎作用;國(guó)內(nèi)研究顯示,HLJDD可改善老年性癡呆(心肝火旺型)患者智力和生活能力,其作用機(jī)制可能與抗自由基有關(guān)。本研究以β-APP基因?yàn)槌霭l(fā)點(diǎn),研究HLJDD治療AD的可能機(jī)制。組織病理顯示,HLJDD和安理申均起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,減緩細(xì)胞凋亡進(jìn)程,減少老年斑沉積的作用,而HLJDD中劑量組的效果顯著優(yōu)于安理申組。也有研究表明,HLJDD可能通過調(diào)控快速老化模型小鼠海馬基因的表達(dá)而發(fā)揮改善認(rèn)知功能障礙的作用[10],與本研究結(jié)果有異曲同工之處。本研究結(jié)果還顯示,中劑量HLJDD降低β-APP基因mRNA轉(zhuǎn)錄的效果明顯優(yōu)于安理申,提示中劑量HLJDD可能是治療AD的有效劑量,可達(dá)到理想的血藥濃度。HLJDD大劑量組療效比中劑量組差,可能因中藥具有雙向調(diào)節(jié)作用,當(dāng)藥物濃度超過一定范圍之后,極有可能對(duì)體內(nèi)某種調(diào)節(jié)機(jī)制產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié),其潛在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為今后摸索和制定中醫(yī)復(fù)方HLJDD的合理治療劑量提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述,HLJDD能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞,有效干預(yù)β-APP基因mRNA轉(zhuǎn)錄,減少老年斑生成,對(duì) AD起防治作用。但 HLJDD對(duì)AD病多靶點(diǎn)、多途徑、多機(jī)制的作用特點(diǎn)及是否還有其它作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

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