趙艷紅 李洪發(fā) 王春玲 鄭朝 付雅麗 魏福蘭

（1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科，天津 300070；2.山東大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科，山東 濟南 250012）

機械力作用下人牙周膜細(xì)胞Osterixm RNA和蛋白的表達(dá)

趙艷紅1李洪發(fā)1王春玲2鄭朝1付雅麗1魏福蘭2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科，天津 300070；2.山東大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科，山東 濟南 250012）

目的 研究在機械力作用下人牙周膜細(xì)胞內(nèi)Osterix（Osx）mRNA和蛋白的表達(dá)變化，探討Osx與正畸牙周組織骨改建的關(guān)系。方法 組織塊法培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，采用離心加力裝置對細(xì)胞分別加載1、2、4、6、8、12 h的機械力。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、Western blot及細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)分別檢測不同時間點Osx mRNA和蛋白的表達(dá)變化及其細(xì)胞定位。結(jié)果 在正常人牙周膜細(xì)胞中，Osx mRNA表達(dá)微弱，蛋白未見表達(dá)；在機械力加載4 h后，Osx mRNA表達(dá)開始明顯增強（P<0.01），蛋白呈現(xiàn)弱表達(dá)（P<0.05）；加載8 h時，Osx mRNA和蛋白表達(dá)顯著增強（P<0.01）；持續(xù)增加至加力12 h。同時，加力4 h后，少量細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)開始呈現(xiàn)微弱的綠色熒光；12 h后，陽性表達(dá)主要集中在胞核內(nèi)。結(jié)論 機械力可誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞Osx表達(dá)增強及活化。Osx可能參與了細(xì)胞內(nèi)生物力學(xué)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而可能在正畸牙周組織的骨改建過程中發(fā)揮著重要作用。

人牙周膜細(xì)胞； 機械刺激； 成骨分化； 骨改建

正畸牙移動是通過機械力作用下牙周組織發(fā)生改建來完成的，其中以牙槽骨改建為主。在此改建過程中，牙周膜的生物力學(xué)反應(yīng)起著至關(guān)重要的介導(dǎo)和調(diào)控作用[1]。其中，牙周膜細(xì)胞是矯治力的直接效應(yīng)細(xì)胞[2]，在牽張力的作用下可向成骨樣細(xì)胞分化，發(fā)生成骨反應(yīng)，促進(jìn)骨改建。牙周膜細(xì)胞受力后骨向分化過程中，機械物理信號轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)生化信號的分子機制比較復(fù)雜，包含多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[3-4]。近年的研究表明，一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子也參與了細(xì)胞內(nèi)調(diào)控途徑，將細(xì)胞外物理或機械刺激轉(zhuǎn)化為協(xié)調(diào)的細(xì)胞反應(yīng)[5-6]。

Osterix（Osx）[7]是新近發(fā)現(xiàn)的一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的骨形成轉(zhuǎn)錄因子。它是成骨細(xì)胞分化和骨形成不可缺少的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。近來少量研究發(fā)現(xiàn)，Osx在牙胚、造釉細(xì)胞瘤牙源性組織中均有陽性表達(dá)，表明Osx可能在牙齒、牙周組織的發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。同時，已有研究證實機械力在誘導(dǎo)部分非成骨細(xì)胞系發(fā)生成骨反應(yīng)過程中，能顯著增強Osx的表達(dá)，指出Osx介導(dǎo)了細(xì)胞外機械刺激向細(xì)胞內(nèi)成骨反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)化[9]。基于以往研究，推測Osx可能參與了機械力誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞成骨分化，從而在正畸牙周組織的骨改建中發(fā)揮一定作用。本實驗采用離心加載裝置對體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞加載機械力，觀察人牙周膜細(xì)胞在持續(xù)受力下Osx mRNA和蛋白的表達(dá)，從細(xì)胞基因和蛋白水平初步探討Osx在正畸牙周組織骨改建中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基（高糖）、胰蛋白酶（Sigma公司，美國），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（杭州四季青生物工程材料有限公司），波形絲蛋白和角蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司），即用型SP免疫組化檢測試劑盒、FITC標(biāo)記兔抗山羊IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司，美國），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluorid，PVDF）膜（Amersham Biosciences公司，瑞典）。

IXZ-ILL100型倒置相差顯微鏡、CX71顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLYMPUS公司，日本），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、臺式冷凍高速離心機（Heraeus公司，德國），5810R型高速臺式離心機（Eppendoff公司，德國），梯度PCR儀（Biometra公司，德國），電泳槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、制膠器（BIO RAD公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定 取11～14歲青少年因正畸拔除的牙周健康的前磨牙。采用組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，取第2代細(xì)胞爬片，用免疫組化SP法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白染色，進(jìn)行來源鑒定。

1.2.2 人牙周膜細(xì)胞的體外加力 本研究采用離心加力法對細(xì)胞加載機械力[10-11]。取生長良好的第2～3代人牙周膜細(xì)胞，按每孔2.5×105個接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞融合80%，換用含2%FBS的條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長及貼壁情況。實驗組與對照組同時種板。將六孔板在無菌條件下用無菌密封膠密封，置于37℃離心機加力支架中，實驗組以離心機加力（631 r·min-1，約80 g相對離心力），加力時間分別為1、2、4、6、8、12 h。此加力方式相當(dāng)于對人牙周膜細(xì)胞施加一個接近正畸臨床的持續(xù)壓力，大小約為16 g·cm-2，屬于正畸臨床輕力范圍[12]。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量測定。應(yīng)用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒建立反應(yīng)體系，離心混勻后置于循環(huán)變溫加熱器進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為：37℃ 1 h，95℃ 5min。生成的cDNA置冰上行后續(xù)實驗或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取2μL cDNA，采用LightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenⅠ建立反應(yīng)體系，放入LightCycler機器內(nèi)，按照實驗說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain raction，RT-PCR）。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10 s、55℃退火10 s、72℃延伸5 s，循環(huán)45次。融解分析產(chǎn)物特異性，電泳鑒定產(chǎn)物大小正確。以β-actin作為內(nèi)參照，用LightCycler Software Ver. 4.0分析目的基因的相對表達(dá)水平。本實驗中除Osx mRNA外同時檢測了成骨標(biāo)志基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨鈣素（osteocalcin，OC）mRNA的表達(dá)，以反映細(xì)胞的成骨分化情況。其中所用基因引物序列具體見表1。

表1 基因引物序列列表Tab 1 Specific primers used for RT-PCR

1.2.4 Western blot檢測 收集細(xì)胞5×106個，冰上加入適量（200μL）細(xì)胞裂解液（50mmol·L-1Tris-HCl、150 mmol·L-1NaCl、1%Triton X-100、1mmol·L-1乙二胺四乙酸、10%丙三醇、0.5mmol·L-1苯甲基磺酰氟化物、10μg·mL-1亮肽酶素和1μg·mL-1抑酞酶），裂解細(xì)胞，低溫離心，獲取全蛋白上清，-80℃保存?zhèn)溆?。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。

取等量蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，后將蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液封閉，加入山羊抗人、鼠Osx多克隆抗體（1∶250）4℃過夜，漂洗后加入用TBS稀釋的辣根酶標(biāo)記兔抗山羊二抗（1∶2 500），搖動反應(yīng)1～2 h進(jìn)行雜交，顯色。實驗以actin作為內(nèi)參照，應(yīng)用JD801圖像分析系統(tǒng)測定目的條帶的相對積分光密度，分析Osx蛋白表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)可直觀地闡述Osx蛋白的表達(dá)、亞細(xì)胞定位，并間接反映其活性狀態(tài)[13]。首先將長有細(xì)胞的玻片放于玻璃器皿內(nèi)，冷丙酮固定，2%Triton-X 100的PBS透化，正常兔血清封閉，滴加用抗體稀釋液稀釋的山羊抗人Osx一抗（1∶100），濕盒中4℃過夜，漂洗后滴加用FITC標(biāo)記的兔抗山羊二抗（1∶100），暗室中在室溫孵育30～60min，PBS徹底漂洗，90%甘油封片。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，隨機選取3個視野，記錄綠色熒光著色分布情況，并拍照，據(jù)此統(tǒng)計分析Osx蛋白陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量及其核內(nèi)陽性表達(dá)的細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定

倒置顯微鏡下觀察，牙周膜組織塊在5～10 d內(nèi)開始有細(xì)胞游出，以組織塊為中心呈放射狀排列生長，20 d左右爬滿培養(yǎng)瓶。人牙周膜細(xì)胞呈長梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，胞核呈圓形或卵圓形，傳代后細(xì)胞生長旺盛、性狀穩(wěn)定，具有成纖維細(xì)胞特性。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果為抗波形絲蛋白陽性、抗角蛋白陰性（圖1）。

2.2 機械力作用下人牙周膜細(xì)胞中ALP和OCmRNA的表達(dá)

在正常人牙周膜細(xì)胞內(nèi)，ALP mRNA表達(dá)較強，而OCmRNA表達(dá)極其微弱。加力1 h后，ALP表達(dá)水平明顯升高，而在加力4 h后，OC表達(dá)水平開始增強，此后兩者持續(xù)增強至加力12 h（圖2）。

圖1 人牙周膜細(xì)胞的來源鑒定 SP ×200Fig 1 The identification of human periodontal ligament cells SP ×200

圖2 機械力作用下人牙周膜細(xì)胞中ALP和OCmRNA的表達(dá)Fig 2 Expression of ALP and OC mRNA in human periodontal ligament cells under mechanical stimulation

2.3 人牙周膜細(xì)胞加力不同時間點Osx mRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Osx mRNA在正常人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)極其微弱。加載離心力后，Osx mRNA的表達(dá)發(fā)生一系列變化：加力1、2 h時，OsxmRNA的表達(dá)略升高，但變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；加力4h時，Osx mRNA開始明顯增強（P＜0.01）；加力8 h時，OsxmRNA表達(dá)顯著增強（P＜0.01）；此后Osx mRNA表達(dá)緩慢增加，持續(xù)到12 h加力結(jié)束（圖3）。

圖3 加力不同時間點人牙周膜細(xì)胞Osx mRNA的表達(dá)變化Fig 3 Effect of mechanical force on expression of OsxmRNA in human periodontal ligament cells

2.4 人牙周膜細(xì)胞加力不同時間點Osx蛋白的表達(dá)

經(jīng)Western blot檢測，Osx蛋白在正常人牙周膜細(xì)胞中未見表達(dá)。細(xì)胞加載離心力1、2 h時，仍未檢測到Osx蛋白表達(dá)（P＞0.05）；加力4 h時，檢測到一條相對分子質(zhì)量為4.6×104的微弱蛋白條帶，說明Osx蛋白開始呈現(xiàn)弱表達(dá)（P＜0.05）；加力6、8 h時，Osx蛋白表達(dá)逐漸增加（P＜0.01）；加力12 h時，Osx蛋白表達(dá)顯著增強，達(dá)到最高水平。變化具有時間依從性（圖4）。

圖4 加力不同時間點人牙周膜細(xì)胞Osx蛋白的表達(dá)變化Fig 4 Effect of mechanical force on expression of Osx protein in human periodontal ligament cells

2.5 免疫熒光檢測結(jié)果

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，正常人牙周膜細(xì)胞內(nèi)無綠色熒光著色；加力1、2 h的細(xì)胞內(nèi)未檢測到Osx陽性表達(dá)產(chǎn)物；加力4 h后，少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)開始呈現(xiàn)微弱的綠色熒光（P＜0.01）；加力8 h時，約40%～50%的細(xì)胞發(fā)出明顯的綠色熒光，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)均有陽性表達(dá)產(chǎn)物；加力12 h時，大部分細(xì)胞（約87%）呈現(xiàn)強陽性表達(dá)，且主要集中在細(xì)胞核內(nèi)（圖5、6）。

圖5 機械力作用下人牙周膜細(xì)胞Osx蛋白綠色熒光陽性表達(dá)的細(xì)胞比例及其核內(nèi)陽性表達(dá)的細(xì)胞比例Fig 5 Percentage changes of Osx protein-positive cells under mechanical stimulation

圖6 機械力作用下人牙周膜細(xì)胞Osx蛋白綠色熒光表達(dá)情況 免疫熒光 ×200 Fig 6 Expression of green fluorescence of Osx protein under mechanical stimulation immunofluorescence ×200

3 討論

3.1 機械力的體外加載

在細(xì)胞生物力學(xué)研究中，如何模擬體內(nèi)的生理水平，對體外細(xì)胞施加機械力刺激并進(jìn)行精確的控制一直是眾多學(xué)者研究重點之一。近幾十年來，對體外培養(yǎng)的細(xì)胞施加機械刺激的裝置已有多種，如流體剪切力[14]、流體靜壓力[15]、膜機械拉伸[16]、離心力[7，10]等方式。本研究采用了離心加力法。施加離心力是可靠的加力方式之一，力值穩(wěn)定，重復(fù)性好。本研究所采用的離心加力方式與一些學(xué)者[7，10]所提出的加力方式類似，即使培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)板上貼壁，然后加載離心力，克服了以往懸浮離心加力時細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間無附著的缺陷。并在加力前換用含2%FBS的培養(yǎng)基使細(xì)胞同步化，使盡可能多的細(xì)胞處于同一細(xì)胞周期，減少不確定因素的影響。本研究為了模擬臨床生理性的正畸輕力并保證細(xì)胞活力，采用了80 g的離心力。此離心力使貼壁生長的牙周膜細(xì)胞受到一個頂-底軸向的持續(xù)壓力，力值為 16 g·cm-2，經(jīng)觀察對細(xì)胞形態(tài)及活力無明顯影響。

3.2 在機械力作用下人牙周膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化

本研究對體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞加載離心力后，早期ALP mRNA表達(dá)水平明顯升高，隨后，OC mRNA表達(dá)也逐漸增強。這與以往研究結(jié)果[17]相一致，ALP和OC都是成骨細(xì)胞的標(biāo)志產(chǎn)物，說明機械力可以誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化。人牙周膜細(xì)胞在牽張力作用下，ALP分泌活性增加，OC蛋白出現(xiàn)較緩慢和晚期的表達(dá)增強，提示人牙周膜細(xì)胞在機械力誘導(dǎo)下能向成骨樣細(xì)胞分化成熟[17]。

3.3 Osx在機械力誘導(dǎo)人牙周膜細(xì)胞成骨分化過程中的表達(dá)

Osx[7]是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控成骨細(xì)胞分化和骨形成的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。人類Osx同源物又稱為Sp7，屬于Sp/XKLF家族[18]。Osx調(diào)控許多重要的成骨基因的表達(dá)，如骨鈣素、骨黏素、骨橋素、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原蛋白。Osx單獨作用就可有效誘導(dǎo)鼠胚胎干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞[19]和脂肪干細(xì)胞[20]分化為成骨細(xì)胞系。Osx基因剔除小鼠胚胎中，成骨細(xì)胞的分化受到阻礙，不能發(fā)生礦化反應(yīng)，完全喪失骨形成能力；出生后不久即因呼吸困難而死去。這些研究說明Osx是成骨細(xì)胞分化和骨發(fā)育不可缺少的調(diào)節(jié)因子。Osx mRNA在牙胚、造釉細(xì)胞瘤牙源性組織中均有陽性表達(dá)。這些表明Osx可能在牙齒、牙周組織的發(fā)育中具有重要的作用[7-8]。

已有研究表明機械力刺激能夠誘導(dǎo)Osx的表達(dá)。Fan等[21]發(fā)現(xiàn)對永生化前成骨細(xì)胞進(jìn)行2%牽張刺激過夜后,Osx的表達(dá)強度增加了2倍。而Mitsui等[22]報道1.0 g·cm-2的持續(xù)壓力在誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞Saos-2發(fā)生成骨反應(yīng)過程中，能顯著增強Osx的表達(dá)。Kanno等[5]研究指出單軸正弦式牽張應(yīng)力（牽張15%）不僅能夠增加成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1和原代成骨細(xì)胞ALP活性和OC的表達(dá)，并顯著增強Osx和核心結(jié)合因子α1表達(dá)。Fan等[9]實驗不僅證實了機械應(yīng)力能夠誘導(dǎo)TOLF細(xì)胞Osx mRNA明顯表達(dá)，并進(jìn)一步驗證了Osx是機械信號的一個關(guān)鍵靶目標(biāo)。

本實驗采用離心加力法對人牙周膜細(xì)胞加載機械力，誘導(dǎo)其向成骨樣細(xì)胞分化，以檢測Osx是否在人牙周膜細(xì)胞內(nèi)機械應(yīng)力轉(zhuǎn)化為成骨反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用。本實驗發(fā)現(xiàn)Osx mRNA在正常人牙周膜細(xì)胞中有極其微弱的表達(dá)，但未檢測到Osx蛋白表達(dá)；在離心力作用的12 h內(nèi)，人牙周膜細(xì)胞內(nèi)Osx mRNA表達(dá)逐漸增強，Osx蛋白表達(dá)從無到有，并逐漸增強，說明機械力能夠顯著增強人牙周膜細(xì)胞內(nèi)Osx基因和蛋白表達(dá)，Osx可能參與了機械力誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞成骨分化的過程。

細(xì)胞免疫熒光檢測技術(shù)通過呈現(xiàn)一定綠色熒光可以對Osx蛋白的活性狀態(tài)提供一個間接的視覺評測[13]。通常情況下，轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞漿內(nèi)激活后，會自細(xì)胞漿移入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)與其他因子協(xié)同調(diào)控其下游基因的表達(dá)[23]。因此，動態(tài)的核轉(zhuǎn)移表明了轉(zhuǎn)錄因子已被激活[13]，具有轉(zhuǎn)錄作用。本實驗結(jié)果顯示，在機械力的持續(xù)作用下，Osx蛋白綠色熒光最先在胞漿內(nèi)發(fā)生，后逐漸集中于細(xì)胞核，核內(nèi)熒光逐漸增強，說明Osx蛋白在胞漿內(nèi)合成并發(fā)生活化，逐漸從胞漿轉(zhuǎn)移到胞核，從而發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化調(diào)控作用[13]，即調(diào)控著其下游礦化基因的表達(dá)[24]和細(xì)胞的成骨分化成熟。由此可見，Osx是機械刺激和人牙周膜細(xì)胞成骨分化間的一個關(guān)鍵性的中間分子環(huán)節(jié)，參與了機械應(yīng)力誘導(dǎo)的牙周膜細(xì)胞成骨分化及礦化反應(yīng)，進(jìn)而在正畸牙周組織的骨改建中發(fā)揮著重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

[1] Kawarizadeh A,Bourauel C,G?tz W,et al.Early responses of periodontal ligament cells to mechanical stimulus in vivo[J].J Dent Res,2005,84（10）：902-906.

[2] Basdra EK,Komposch G.Osteoblast-like properties of human periodontal ligament cells：An in vitro analysis[J].Eur J Orthod, 1997,19（6）：615-621.

[3] Bakker AD,Soejima K,Klein-Nulend J,et al.The production of nitric oxide and prostaglandin E（2）by primary bone cells is shear stress dependent[J].J Biomech,2001,34（5）：671-677.

[4] Ryder KD,Duncan RL.Parathyroid hormone enhances fluid shear-induced[Ca2+]signaling in osteoblastic cells through activation of mechanosensitive and voltage-sensitive Ca2+channels[J].J Bone Miner Res,2001,16（2）：240-248.

[5] Kanno T,Takahashi T,Tsujisawa T,et al.Mechanical stressmediated Runx2 activation is dependent on Ras/ERK1/2 MAPK signaling in osteoblasts[J].J Cell Biochem,2007,101（5）：1266-1277.

[6] Wei F,Wang C,Zhou G,et al.The effect of centrifugal force on the mRNA and protein levels of ATF4 in cultured human periodontal ligament fibroblasts[J].Arch Oral Biol,2008,53（1）：35-43.

[7] Nakashima K,Zhou X,Kunkel G,et al.The novel zinc fingercontaining transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation[J].Cell,2002,108（1）：17-29.

[8] Kumamoto H,Ooya K.Expression of bone morphogenetic proteins and their associated molecules in ameloblastomas and adenomatoid odontogenic tumors[J].Oral Dis,2006,12（2）：163-170.

[9] Fan D,Chen Z,Wang D,et al.Osterix is a key target for mechanical signals in human thoracic ligament flavum cells[J].J Cell Physiol,2007,211（3）：577-584.

[10]Fitzgerald J,Hughes-Fulford M.Mechanically induced c-fos expression is mediated by cAMP in MC3T3-E1 osteoblasts[J]. FASEB J,1999,13（3）：553-557.

[11] Redlich M,Asher Roos H,Reichenberg E,et al.Expression of tropoelastin in human periodontal ligament fibroblasts after simulation of orthodontic force[J].Arch Oral Biol,2004,49（2）：119-124.

[12]Davidovitch Z.Tooth movement[J].Crit Rev Oral Biol Med,1991, 2（4）：411-450.

[13] Tai G,Christodoulou I,Bishop AE,et al.Use of green fluorescent fusion protein to track activation of the transcription factor osterix during early osteoblast differentiation[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,333（4）：1116-1122.

[14]Kapur S,Baylink DJ,Lau KH.Fluid flow shear stress stimulates human osteoblast proliferation and differentiation through multiple interacting and competing signal transduction pathways [J].Bone,2003,32（3）：241-251.

[15] Yousefian J,Firouzian F,Shanfeld J,et al.A new experimental model for studying the response of periodontal ligament cells to hydrostatic pressure[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop,1995, 108（4）：402-409.

[16]Liu J,Zou L,Zheng Y,et al.NF-kappaB responds to mechanical strains in osteoblast-like cells,and lighter strains create an NF-kappaB response more readily[J].Cell Biol Int,2007,31（10）：1220-1224.

[17]Yang YQ,Li XT,Rabie AB,et al.Human periodontal ligament cells express osteoblastic phenotypes under intermittent force loading in vitro[J].Front Biosci,2006,11：776-781.

[18] Gao Y,Jheon A,Nourkeyhani H,et al.Molecular cloning, structure,expression,and chromosomal localization of the human Osterix（SP7）gene[J].Gene,2004,341：101-110.

[19] Tu Q,Valverde P,Chen J.Osterix enhances proliferation and osteogenic potential of bone marrow stromal cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,341（4）：1257-1265.

[20] Wu L,Wu Y,Lin Y,et al.Osteogenic differentiation of adipose derived stem cells promoted by overexpression of osterix[J].Mol Cell Biochem,2007,301（1/2）：83-92.

[21] Fan X,Rahnert JA,Murphy TC,et al.Response to mechanical strain in an immortalized pre-osteoblast cell is dependent on ERK1/2[J].J Cell Physiol,2006,207（2）：454-460.

[22] Mitsui N,Suzuki N,Maeno M,et al.Optimal compressive force induces bone formation via increasing bone morphogenetic proteins production and decreasing their antagonists production by Saos-2 cells[J].Life Sci,2006,78（23）：2697-2706.

[23] Villard J.Transcription regulation and human diseases[J].Swiss Med Wkly,2004,134（39/40）：571-579.

[24] Hatta M,Yoshimura Y,Deyama Y,et al.Molecular characterization of the zinc finger transcription factor,Osterix[J].Int J Mol Med,2006,17（3）：425-430.

（本文編輯 王晴）

Expression of Osterix mRNA and protein levels in cultured human periodontal ligament cells after mechanical stimulation

ZHAO Yan-hong1,LI Hong-fa1,WANG Chun-ling2,ZHENG Zhao1,FU Ya-li1,WEI Fu-lan2.（1.Dept.of Orthodontics,Stomatological Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin300070,China;2.Dept.of Orthodontics,School of Stomatology,Shandong University,Jinan250012,China）

ObjectiveTo examine the expression of Osterix（Osx）mRNA and protein after application ofmechanical force on human periodontal ligament cells（HPDLCs）,and to investigate the role of Osx in orthodontic alveolar bone remodeling.MethodsHPDLCs were isolated and culturedin vitrowith explant method.Approximately 2.5×105cells were seeded onto six-well cell culture plates and then were exposed to centrifugal force for 1,2,4,6,8 or 12 h at 631 r·min-1.The expression of Osx mRNA and protein was measured by reverse transcription-polymerase chain raction（RT-PCR）and Western blot respectively.Immunofluorescence assay was used to detect the expression and subcellular localization of Osx protein by green fluorescence.Results At the initial time point,OsxmRNA had a weak expression and protein was not detected.Under the mechanical stimulation,both mRNA and protein levels of Osx were upregulated in a time-dependent manner.Furthermore,Osx protein was translocated gradually from the cytosol into the cell nuclei.ConclusionThe expression and activation of Osx were enhanced by mechanical stress in HPDLCs, which indicates that Osx may play an important role in HPDLCs osteogenic differentiation and periodontal tissue remodeling induced by mechanical stress.

human periodontal ligament cells；mechanical stimulation；osteogenic differentiation；bone remodeling

Q 786

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.02.025

1000－1182（2010）02－0214-05

2009-07-23；

2010-01-29

天津醫(yī)科大學(xué)科學(xué)基金資助項目（2008ky09）

趙艷紅（1979—），女，山東人，講師，博士

王春玲，Tel：0531-88382070

·病例報告·