鄒亞峰 王國臣

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制蛋白(IAP),1995年,Altier利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體 1(EPR 1)cDNA在人基因組織庫中篩選克隆出 Survivin基因。Survivin蛋白的組織分布特征有明顯的細(xì)胞選擇性,它表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織,不見于終末分化的正常成人組織(胸腺和生殖腺除外),但在體內(nèi)外的分化組織、人類大多數(shù)腫瘤組織內(nèi)有 Survivin蛋白的表達(dá)。該蛋白可被自身固有T細(xì)胞所識(shí)別,具有抗原性,血清中其抗體稱為抗 Survivin抗體。目前,國內(nèi)外綜合治療對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者血清抗 Survivin抗體水平的臨床研究甚少,多數(shù)為關(guān)于 Survivin蛋白與臨床療效的觀察研究,且結(jié)論多由統(tǒng)計(jì)腫瘤患者的生存期,或體外實(shí)驗(yàn)研究得出,鮮有探索臨床治療與非小細(xì)胞肺癌患者血清抗Survivin抗體之間的相互關(guān)系的臨床觀察研究。本實(shí)驗(yàn)用通過用 ELISA法對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者化療前后血清中抗 Survivin抗體的測(cè)定,檢測(cè)抗存活素抗體變化,觀察治療效果,從而指導(dǎo)臨床治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集 2007年 4月至 2008年 10月我院確診的非小細(xì)胞肺癌患者 260例(非小細(xì)胞肺癌組),其中男 158例,女 102例;年齡 20～78歲,平均年齡 59.14歲;其中腺癌 140例,鱗癌 120例。TNM分期Ⅱ期 20例,ⅢA期 100例,ⅢB期30例,Ⅳ期 110例。25～50歲的健康體檢者 68例(對(duì)照組),男 49例,女 19例。所有患者采集清晨空腹靜脈血 2ml,離心,3 000 r/min,10min,取上清液,-20℃凍存。260例非小細(xì)胞肺癌患者血清標(biāo)本(非小細(xì)胞肺癌組),以及經(jīng)ELISA法檢測(cè)后證實(shí)為抗 Survivin抗體陽性的 65例化療患者每周期化療后 1周采血經(jīng)離心后的血清標(biāo)本(化療組)和對(duì)照組 68例的血清標(biāo)本。

1.2 化療方案 吉西他濱第 1、8天靜脈點(diǎn)滴,1 000mg/m2,順鉑第 1～3天靜脈點(diǎn)滴,30 mg/m2。21 d為 1周期,共 4個(gè)周期。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 人抗Survivin抗體/生存蛋白(SurvAb)酶聯(lián)免疫分析試劑盒。

1.4 檢測(cè)方法 血清抗 Survivin抗體濃度測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法,嚴(yán)格按說明書實(shí)驗(yàn)步驟操作,450 nm光波檢測(cè)吸光度。

1.5 計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)樣品的OD值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品的濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實(shí)際濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,采用 t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組不同性別抗 Survivin抗體檢測(cè)結(jié)果 抗 Survivin抗體男 1.3857±0.0822,女 1.4179±0.0884,對(duì)照組不同性別抗 Survivin抗體表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組 抗Survivin抗體測(cè)量結(jié)果比較 抗 Survivin抗體對(duì)照組中檢測(cè)結(jié)果均為陰性,非小細(xì)胞肺癌組中陽性 134例,表達(dá)率 51.5%,其表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。見表 1。

表 1 2組 Survivin抗體檢驗(yàn)結(jié)果比較 例(%)

2.3 化療組化療前后抗 Survivin抗體測(cè)量結(jié)果 化療組化療前與化療 1周期 Survivin抗體表達(dá)兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),4個(gè)周期化療期間抗 Survivin抗體表達(dá),1周期與2周期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),2周期與 3周期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3周期與 4周期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表 2。

表 2 化療組化療前后抗存活素抗體測(cè)量結(jié)果n=65,±s

表 2 化療組化療前后抗存活素抗體測(cè)量結(jié)果n=65,±s

注：與化療 1周期比較,＊P＜0.05;與化療 2周期比較,#P＜0.05

化療組 抗 Suvnivin化療前 2.49±0.71化療 1周期 2.42±0.54化療 2周期 1.95±0.44＊化療 3周期 1.60±0.28＊#化療 4周期 1.46±0.26＊#

3 討論

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制蛋白(IAP),1995年,Altier利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體 1(EPR 1)cDNA在人基因組織庫中篩選克隆出Survivin基因[1],Survivin基因全長(zhǎng) 15kb,位于 17q25,由分子大小為 1.9kb的 mRNA所編碼,是一個(gè) 143個(gè)氨基酸的蛋白,它不僅含有單一的桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列(BIR)功能區(qū)、而且沒有環(huán)指結(jié)構(gòu)[2]。Survivin與其他凋亡因子不同,除參與凋亡的控制外,還特異地在細(xì)胞周期G 2/M期表達(dá),通過與細(xì)胞有絲分裂紡錘體的微管結(jié)合,參與對(duì)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。Survivin依賴細(xì)胞增殖信號(hào)介導(dǎo)而進(jìn)入核內(nèi),與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子 Cdk4結(jié)合,導(dǎo)致 Cdk2/Cyclin的激活和 Rb磷酸化,Survivin/Cdk4的形成使 P21釋放[3],P21通過緊密結(jié)合于 G1期和 S期的蛋白激酶(cyclin D 1-Cdk4和 Cyclin ECdk2),抑制其活性,對(duì)細(xì)胞增殖停留在 G1期具有重要的重用,P21的解離使 Cdk 4活化,細(xì)胞進(jìn)入增殖周期,最終導(dǎo)致大量細(xì)胞無限制增殖。

Survivin蛋白的組織分布特征有明顯的細(xì)胞選擇性,它表達(dá)于胚胎和發(fā)育的胎兒組織,不見于終末分化的正常成人組織(胸腺和生殖腺除外),但在體內(nèi)外的分化組織、人類大多數(shù)腫瘤組織內(nèi)有 Survivin蛋白的表達(dá)[4]。該蛋白可被自身固有 T細(xì)胞所識(shí)別,具有抗原性,血清中其抗體稱為抗Survivin抗體。癌細(xì)胞的 Survivin過表達(dá)可導(dǎo)致抗Survivin抗體和細(xì)胞毒性 T-淋巴細(xì)胞抗癌反應(yīng)[5,6]。目前,Survivin的基因表達(dá)情況可以通過分子生物學(xué)、免疫組化、血清抗Survivin抗體等多種方法檢測(cè),但前兩種方法由于操作復(fù)雜繁瑣,不易在臨床上推廣,而血清學(xué)方法由于具有操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,不需要蠟塊等優(yōu)點(diǎn),在臨床上已見報(bào)道。2000年 Rohayem等[6]首先報(bào)道了用ELISA法檢測(cè)肺癌和結(jié)直腸癌患者血清中的抗Survivin抗體,其中肺癌患者 51例,結(jié)直腸癌患者 49例,在其實(shí)驗(yàn)中,肺癌患者抗Survivin抗體陽性,陽性率為 21.6%(11/51),結(jié)直腸癌患者抗Survivin抗體陽性,陽性率為 8.2%(4/49)。并且發(fā)現(xiàn)抗Survivin抗體在肺癌患者中有相當(dāng)高的流行率,令人感興趣的是在肺癌的細(xì)胞株中 Survivin的表達(dá)水平尤其高。因此Survivin可以被認(rèn)為是一種主要的腫瘤抗原[7]。國內(nèi)董德瓊等[8]報(bào)道用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者血清中的抗Survivin抗體 34例,抗Survivin抗體陽性率為 32.5%(11/34),高于21.6%的陽性率的報(bào)道,且有治療后較治療前有明顯下降。以高于對(duì)照組均值 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為非小細(xì)胞肺癌抗Survivin抗體陽性的診斷標(biāo)準(zhǔn)。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中,收集了 260例非小細(xì)胞肺癌患者治療前的血清,所有患者均符合世界衛(wèi)生組織/國際肺癌學(xué)會(huì)(WTO/LASLA)肺和胸膜腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[9],用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法檢測(cè)其血清中的抗Survivin抗體,其陽性率為 51.5%(134/260,手術(shù)組 69,化療組65例),高于以往報(bào)道,可能與我們所用的試劑有關(guān)。為了便于比較治療前后抗 Survivin抗體的變化,我們剔除了抗體陰性的非小細(xì)胞肺癌患者及未經(jīng)治療者,其中 65例行化療,吉西他濱 +順鉑,4個(gè)周期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以高于對(duì)照組均值 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為非小細(xì)胞肺癌抗 Survivin抗體陽性的診斷標(biāo)準(zhǔn)：1.3946+2×0.0846=1.56 U/ml。健康對(duì)照組全部陰性,Survivin在正常組織中不表達(dá)。這表明檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者血清中的抗Survivin抗體,用于肺惡性疾病的診斷及鑒別診斷具有一定的特異性。

在化療組中,非小細(xì)胞肺癌患者 65例,化療前抗體水平2.4865±0.7149,化療 1周期后 1周,抗體水平為 2.4215±0.5357,化療 2周期后 1周測(cè)抗體,抗體水平為 1.9522±0.4370,抗 Survivin抗體 3周期后測(cè) Survivin抗體,抗體水平為1.6026±0.2838,抗 Survivin抗體陰性 24例,占 36.8%(24/65)。4周期后測(cè) Survivin抗體,抗體水平為 1.4597±0.2561,由此可見,非小細(xì)胞肺癌患者抗Survivin抗體陽性患者,隨著化療周期的延長(zhǎng),其抗體水平逐步下降,考慮：(1)與化療藥殺滅腫瘤細(xì)胞,減小腫瘤負(fù)荷,減少血源性播散有關(guān)。(2)抗 Survivin抗體陽性的非小細(xì)胞肺癌患者,隨著化療周期的延長(zhǎng),其抗體水平逐步下降,與化療藥的時(shí)間-劑量相關(guān)。2006年的Pignon等[10]的 LACE(肺癌含鉑輔助化療評(píng)估)薈萃分析,對(duì) 5項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn),共 4 584例患者,所有的薈萃分析顯示：順鉑為主的輔助化療顯著延長(zhǎng)了患者的生存期,獲益的程度與腫瘤的期別相關(guān),并首次確定了順鉑劑量的重要地位,其中劑量必須超過300mg?；熃M中,65例非小細(xì)胞肺癌患者均經(jīng) 4個(gè)周期的化療,其順鉑總劑量均大于 300mg。通過 4個(gè)周期的化療,該組化療患者,抗 Survivin抗體總的水平有所下降,說明抗Survivin抗體的高表達(dá)與 Survivin高表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖失控具有一致性,可能是非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥進(jìn)而惡性增殖的原因。Olie等[11]研究發(fā)現(xiàn),利用Survivin反義核酸技術(shù),可使腫瘤細(xì)胞 Survivin mRNA減少而caspase-3活性增加,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,并增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性。

1 AmbrosiniG,Adida C,Sirugo G,et al.Induction of apoptosisand inhibition of cellproliferation by survivin gene targeting.BiolChem,1998,273：11177-11182.

2 AmbrosiniG,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin,expressed in cancer and lymphoma.Nat Med,1997,3：917-921.

3 Suzuki A,Ito T,Kawano H,et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with Cdk4 to resist Fas-mediated cell death.Oncogene,2000,19：1346-1353.

4 Takahashi R,Deveraux Q,Tamm I,et al.A single BIR domain of XIAP sufficient for inhibiting caspases.Biol Chem,1998,273：7787-7790.

5 Schm itz M,Diestelkoetter P,Weigle B,et al.Generation of survivinspecific CD 8+T effector cells by dendritic cells pulsed with protein or selected peptides.Cancer Res,2000,60：4845-4849.

6 Rohayem J,Diestelkoetter P,Weigle B.et al.Antibody response to the tumor-associated inhibitor of apoptosis protein survivin in cancer patients.Cancer Res,2000,60：1815-1817.

7 Tamm I,Wang Y,Sausville E,et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD 95),Bax,caspases,and anti-cancer drugs.Cancer Res,1998,58：5315-5320.

8 董德瓊,楊渝浩.非小細(xì)胞肺癌患者血清抗-Survivin抗體、P53抗體水平的研究.貴州醫(yī)藥,2005,29：969-970.

9 鐘雪云.肺和胸膜腫瘤的病理組織學(xué)新分類.中國腫瘤,2000,9：129-130.

10 Pignon JP,Tribodt H,Scagliotti GV,et al.Lung Adjuvant Cisplatin Evaluation(LCAE)：a pooled analysis of five random ized clinical trials including 4584 patients.Proc Am Soc Clin Onocol,2006,18：s336.

11 OlieRA,Simoes-WustAP,Baumann B,et al.A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy.Cancer Res,2000,60：2805-2810.