馮艷敏 孫嘉琳 胡坤 張世奇 朱秀珊 張云 陳自輝

放射治療、化學(xué)治療等傳統(tǒng)治療腫瘤的方法雖然殺傷作用強,但選擇性很弱,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也大量殺傷正常細(xì)胞,導(dǎo)致治療效果難以令人滿意。提高細(xì)胞免疫能力以達(dá)到治療腫瘤的目的,是目前腫瘤生物治療研究的重要方向。把超抗原(superantigen,SAg)應(yīng)用于腫瘤的免疫治療,是在抗腫瘤實驗研究的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的腫瘤免疫治療研究模式[1-3]。超抗原是一類能直接激活某些T細(xì)胞亞型或 B細(xì)胞亞型的結(jié)構(gòu)上相似的一類蛋白質(zhì),引起眾多細(xì)胞因子釋放,激活 T、B、抗原呈遞細(xì)胞(APC)、殺傷細(xì)胞(NK)等細(xì)胞;另一方面,也可導(dǎo)致免疫抑制、免疫耐受和無能應(yīng)答[4]。金黃色葡萄球菌腸毒素 A(SEA)是金黃色葡萄球菌的產(chǎn)物,可直接與APC膜上的主要組織相容性復(fù)合體 MHCⅡ類分子的肽結(jié)合溝外側(cè)的高度保守區(qū)結(jié)合,使表達(dá)有T細(xì)胞抗原受體TCRV區(qū)的 T細(xì)胞大量激活[5],強烈誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。由于 SEA誘導(dǎo)的CTL對腫瘤細(xì)胞有強大的殺傷作用,因此應(yīng)用 SEA進行抗腫瘤治療得到了人們的熱切關(guān)注[6]。外周血單核細(xì)胞(PBMC)是不均一的細(xì)胞群體,包括CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、NK等免疫活性細(xì)胞。CD4T和 CD8T細(xì)胞亞群發(fā)揮特異性殺腫瘤效應(yīng),而NK細(xì)胞的殺瘤活性不具特異性,這些免疫細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮主要作用。免疫細(xì)胞表面受體和相應(yīng)配體結(jié)合后,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo),活性增強,其殺瘤活性提高。超抗原為多克隆細(xì)胞激活劑,能在極低的濃度下激活免疫細(xì)胞[7]。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌BL21(DE3)為本實驗室保存;重組質(zhì)粒pET22b-SEA由大連寶生物工程公司合成;IPTG為 Solarbio產(chǎn)品;His?Bind Buffer Kit蛋白純化試劑盒購于 Novagen公司;DNA及蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為 Promega公司產(chǎn)品;人肺腺癌細(xì)胞A 549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所;人外周血白膜購自天津市血液中心;DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購自 Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)為上海生工生物工程公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、G 418、二甲基亞砜(DMSO)均為 Promega公司產(chǎn)品;

1.2 方法

1.2.1 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將重組質(zhì)粒 pET22b-SEA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3),挑取單菌落于 LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至 A 600≈0.5時,加 IPTG至終濃度 1mmol/L,30℃振蕩過夜培養(yǎng),收集菌體,將菌體用 50mmol/L Tris-HCl pH 8.0懸浮,冰浴中超聲破菌,14 000 r/min離心10min分離上清液與沉淀,進行SDS-PAGE分析。

1.2.2 SEA蛋白的分離純化：將超聲波破菌后得到的沉淀用含 2mmol/L尿素的 50mmol/L、Tris-HCl pH 8.0洗滌 2次后,加入變性劑(8 mmol/L尿素,3mmol/L EDTA,50mmol/L Tris-HCl pH 8.0)溶解包涵體,14 000 r/min離心 10min,收集上清液,將變性后的上清液裝入透析袋中,在 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0中,4℃下過夜透析。將透析后所得溶液 14 000 r/min離心 10m in,去掉透析過程中形成的沉淀,上清液用 His?Bind Buffer Kit進行純化,膠床先用 1×Binding Buffer平衡后,將之與樣品蛋白進行結(jié)合,用 1×Washing Buffer漂洗 3遍,1×Elute Buffer洗脫 4遍。收集洗脫液,用 SDS-PAGE對產(chǎn)物進行鑒定。

1.2.3 PBMC的分離：取健康成人外周血(含抗凝劑),用0.9%氯化鈉溶液 1∶1稀釋成血液稀釋液,將稀釋液緩慢加至含淋巴細(xì)胞分離液的離心管中(稀釋液與淋巴細(xì)胞分離液的比例為 2∶1),2 000 r/min,離心 20min。小心吸取單核細(xì)胞層,加入 4倍體積的 DMEM高糖培養(yǎng)基,混勻,2 000 r/m in,離心10min,棄去上清,重復(fù) 1次,最后加入 DMEM完全培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度為 2×106/ml,于 5%CO2、37℃孵育培養(yǎng)。

1.2.4 SEA蛋白誘導(dǎo) PBMC殺傷人肺腺癌細(xì)胞 A549：取對數(shù)生長期的 A549細(xì)胞胰酶消化成單細(xì)胞懸液,用含 10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基將腫瘤細(xì)胞濃度調(diào)至 2×105/ml,100μl/孔鋪于 96孔板中;將純化后的 SEA蛋白原液用 20 mmol/L HEPES進行 10倍順序稀釋,使 96孔板每孔 SEA終濃度分別為10、1、0.1、0.01 g/ml,加入相應(yīng)孔中與細(xì)胞共育,每組設(shè) 6個復(fù)孔;同時效靶比設(shè) 5∶1、10∶1和 20∶1 3組對照,加 PBMC 100μl/孔與癌細(xì)胞混合;將 96孔板置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng),分別于 12、36、60h后測定 PBMC的殺瘤活性。另設(shè)空白、效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞對照。

1.2.5 MTT法測定殺瘤活性：每孔加入 MTT(5 g/L)11 L,繼續(xù)孵育 4 h,取出離心,棄上清,加入 150μl DMSO,以 490 nm波長檢測各孔吸光度(A)值,根據(jù)公式計算殺傷率：殺傷率(%)=[1-(實驗組A值 -效應(yīng)細(xì)胞對照A值)/靶細(xì)胞對照 A值]×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,采用單因素方差分析和t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SEA的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒 pET22b-SEA轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3),加入終濃度 1mmol/L ITPG過夜誘導(dǎo),離心收集菌體,超聲波破碎細(xì)胞后分離上清與沉淀,SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見圖 1。表達(dá)產(chǎn)物的蛋白分子量約 30 kDa,與理論值大小一致,而轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒 pET22b的大腸桿菌總蛋白抽提液中未出現(xiàn)這一條帶。說明重組質(zhì)粒 pET22b-SEA在大腸桿菌 BL21(DE 3)中成功表達(dá)。

圖 1 SEA在大腸桿菌 BL21(DE 3)中的表達(dá)

2.2 目的蛋白的純化 將獲得的包涵體經(jīng)洗滌、變性、復(fù)性后,用 His?Bind Bu ffer Kit試劑盒進行純化,所得洗脫液進行SDS-PAGE分析(圖 2)。蛋白電泳結(jié)果表明目的蛋白已經(jīng)得到了較好的純化。

圖 2 SEA的純化

2.3 SEA誘導(dǎo) PBMC殺傷人肺腺癌細(xì)胞A 549的顯微觀察

圖 3 SEA誘導(dǎo) PBMC殺傷 A549的顯微觀察(×200)

表1 不同濃度SEA誘導(dǎo)不同效靶比人PBMC在不同作用時間殺瘤活性比較%,±s

表1 不同濃度SEA誘導(dǎo)不同效靶比人PBMC在不同作用時間殺瘤活性比較%,±s

SEA(g/m l) 12 h 5∶1 10∶1 20∶1 36 h 5∶1 10∶1 20∶1 60 h 5∶1 10∶1 20∶1對照組 14.2±3.5 17.3±2.5 17.9±4.9 19.0±2.0 19.7±5.4 21.0±2.7 21.0±2.7 26.1±4.5 26.9±2.7 0.01 20.8±1.1 21.1±4.6 23.0±2.8 31.1±3.0 40.0±2.5 46.0±1.6 33.6±3.5 39.3±2.8 43.1±3.4 0.1 21.9±4.7 23.3±2.1 29.7±2.2 39.2±2.7 42.9±3.3 48.9±3.7 37.2±3.2 47.6±5.5 51.9±1.6 1 23.4±2.1 29.3±6.3 32.7±1.4 42.7±1.4 53.6±6.5 56.1±2.5 43.5±1.1 48.3±3.2 53.8±3.4 10 26.9±1.8 29.9±2.1 33.0±3.0 46.3±2.6 54.5±4.6 57.2±2.9 45.0±2.6 53.5±3.7 56.8±2.1

將抽提出的 SEA蛋白原液經(jīng)濾膜過濾除菌(0.2μm),并用20mmol/L HEPES將其濃度稀釋成 10、1、0.1、0.01 g/m l,設(shè)效靶比為 5∶1、10∶1、20∶1和對照共 4組,加 PBMC 100 μm/孔與癌細(xì)胞 37℃、5%CO2共育。從圖 3中可以看出,A為未加入SEA和 PBMC的 A549細(xì)胞;B為加入 SEA和 PBMC 12 h后的照片,可見 PBMC在 SEA的誘導(dǎo)下聚集在 A 549的周圍,對其進行免疫攻擊;C為加入 SEA和 PBMC 60 h后的情況,PBMC在SEA的誘導(dǎo)下對 A549細(xì)胞進行殺傷,圖中黑色團狀物質(zhì)即為經(jīng) SEA誘導(dǎo)后 PBMC殺死的 A 549細(xì)胞。

2.4 不同濃度SEA誘導(dǎo)人PBMC不同時間殺瘤活性的結(jié)果

總體上隨著 SEA濃度的升高,PBMC對腫瘤細(xì)胞的殺傷率也隨著升高,0.01、0.1、1 g/ml組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而 SEA濃度 10g/ml與 1g/ml組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),所以在一定范圍內(nèi) PBMC的殺瘤活性隨 SEA濃度的升高而增強;在與SEA作用36h后PBMC對腫瘤的殺傷作用明顯高于短作用時間組(12h),殺傷率在12 h和36 h組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而隨著作用時間延長至 60 h時,殺傷率并未出現(xiàn)顯著升高,與 36 h組間無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),說明過長的誘導(dǎo)時間對增強殺瘤活性沒有明顯的作用;隨著效靶比的增加,殺瘤活性也隨之提高(P＜0.05)。見表 1。

3 討論

超抗原是一種強大的免疫激活因子,無須 APC的加工處理,可直接結(jié)合 APC的 MHCⅡ類分子和 TCRV鏈,激活大量 T細(xì)胞,通過細(xì)胞毒作用(SDCC)和細(xì)胞因子的直接和間接殺傷作用起到抑瘤作用。超抗原活化的 CD8+T細(xì)胞 MHCⅡ類分子與 MHCⅡ類陽性的腫瘤細(xì)胞相偶聯(lián),即可對后者發(fā)揮強烈的殺傷作用。另一方面,超抗原活化的CD4+T細(xì)胞也具有直接殺傷表達(dá) MHCⅡ類分子腫瘤細(xì)胞功能,而且可增強腫瘤細(xì)胞表達(dá) MHCⅡ抗原分子,增強癌細(xì)胞刺激宿主免役系統(tǒng)的能力;同時,這些細(xì)胞因子又刺激 T細(xì)胞進一步增殖分化,又產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子與 SDCC作用共同導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的溶解。以SE等細(xì)菌性超抗原誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的殺瘤活性,是近年來應(yīng)用超抗原進行腫瘤生物治療的基本研究思路[8,9]。

本實驗結(jié)果可以得出,在總體趨勢上,隨著加入SEA濃度的升高,PBMC的殺傷活性也隨著提高,而濃度高于 1 g/m l時,單純增加濃度不會對提高殺傷效率產(chǎn)生明顯作用。有可能由于高濃度的SEA與PBMC作用,誘導(dǎo)出無能 T細(xì)胞的形成,也可能由于PBMC無法與過量的SEA作用,此機制尚不清楚。在作用時間方面,SEA與 PBMC作用初期延長作用時間可以明顯增強殺瘤效果,而當(dāng)誘導(dǎo)時間延長至 60 h后,殺瘤活性并未繼續(xù)增強,所以當(dāng)作用時間達(dá)一定程度時,單純延長反應(yīng)時間也無法提高殺瘤活性。同時殺傷效果還與效靶比呈正相關(guān)。

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