張馨月,冉多良,葉偉成,袁秀芳,王一成,劉蔓雯,張 存*

(1.浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,浙江杭州310021;2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院,新疆烏魯木齊830052)

鴨瘟(Duck enteritis)是由鴨瘟病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鴨、鵝、雁及其他雁形目禽類的急性、敗血性、高度致死性傳染病,其特點是流行廣泛,傳播迅速,發(fā)病率和死亡率高[1-2],給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失。鴨瘟病毒屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科,衣殼為20面體對稱,有囊膜。鴨瘟病毒的DNA具典型的皰疹病毒DNA的特征,基因組為線狀雙股DNA,大小約為150 kb[3]。近年來,鴨瘟病毒基因研究取得了顯著的進展,TK、UL24、gH、gD、UL6等基因的序列陸續(xù)得到克隆和測序[2]。

α皰疹病毒可以作為活的病毒載體,病毒基因組大,有廣泛的非必需區(qū)存在,其中TK基因就是一個常用的非必需區(qū),在TK基因內(nèi)部插入外源基因能夠得到有效的表達。重組α-皰疹病毒已經(jīng)成為研究動物多價重組病毒疫苗的重要手段,成功建立了多種動物的皰疹病毒載體系統(tǒng),如豬偽狂犬病病毒(PRV)、雞馬立克病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)[2-5],而鴨瘟病毒在這一領域的研究尚屬空白。本文構建了以TK基因及其相鄰UL24基因序列為同源重組臂、用Pcmv啟動子控制外源基因表達的轉移載體pTK-GFP,為研究重組鴨瘟病毒和構建具有遺傳標記的鴨瘟弱毒疫苗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒載體、工程菌 pMD18-T載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;pADtrack質粒及E.coli宿主菌TOP10由本實驗室保存。

1.1.2 細胞和病毒 按常規(guī)方法取9日齡～10日齡SPF雞胚(購自山東省農(nóng)科院家禽所)制備雞胚成纖維細胞單層,增殖DEV強毒和疫苗毒。DEV強毒株京A購自中監(jiān)所,弱毒株為疫苗毒(上海松江生物制品廠)。

1.1.3 酶和試劑 p fu酶、Ex Taq酶、蛋白酶K、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、K lenow聚合酶、pMD18-T克隆載體、DNA膠回收試劑盒等,為寶生物工程(大連)有限公司和上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品。

LipofectamineTM2000脂質體和MEM為Invitrogen公司產(chǎn)品。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組的提取 按文獻[3]方法提取鴨瘟病毒強毒株和疫苗株基因組DNA。

1.2.2 鴨瘟病毒TK基因的克隆和序列分析

1.2.2.1 鴨瘟病毒TK基因的擴增和克隆 根據(jù)GenBank中收錄的DEV TK和UL24基因序列(序列號AY911509),設計1對引物,可以擴增TK基因全長和UL24基因5′端982 bp的片段,P1:5′-TCAATTAATTGTCATCTCGGTATTG-3′;P2:5′-CAGTTGCATTGCCGTGTGGTA-3′。

Ex Taq酶PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳切膠回收目的DNA條帶,按試劑盒操作說明書直接連接克隆到pMD18-T載體中。以Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切鑒定陽性重組質粒,分別命名為pMDT-TK(弱毒)和pMDT-TKV(強毒),并送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.2.2 鴨瘟病毒TK基因的序列分析 用DNA Star軟件對測序的鴨瘟強弱毒TK基因序列進行比較分析,同時將所測的序列與Gen Bank中的鴨瘟病毒TK基因序列進行同源性比較。

1.2.3 TK基因轉移載體的構建

1.2.3.1 重組臂的克隆 以pMDT-TK為模板,以p fu酶和引物P1、P2擴增TK-UL24基因DNA片段,凝膠電泳回收約2.0 kb DNA片段,pUC18載體以Hin dⅢ和Eco RⅠ雙酶切后補平末端。按常規(guī)方法連接、轉化、酶切鑒定,篩選重組質粒pTK。1.2.3.2 Pcmv-GFP-pA真核表達盒的擴增和克隆根據(jù)公開發(fā)表的pADtrack DNA序列設計一對引物,分別位于Pcmv啟動子的上游和polyA下游,可以擴增出Pcmv-GFP-polyA完整的基因表達盒,P3:5′-ATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAA-3′;P4:5′-TTTGGATCCTTATATATTCTTTCCCACCCTTA -3′,其中下游引物中包含了Bam HⅠ酶切位點。

p fu酶PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳切膠回收目的DNA條帶,BamHⅠ酶切回收;pTK質粒以XhoⅠ酶切后K lenow聚合酶補平末端,再以Bam HⅠ酶切,切膠回收載體大片段。按常規(guī)方法,連接、轉化、酶切鑒定和測序驗證,篩選重組質粒pTK-GFP。

1.2.3.3 重組質粒pTK-GFP大量提取 轉移載體pTK-GFP和pTK質粒的大量提取采用聚乙二醇沉淀法純化,方法參見文獻[4]。

1.2.4 細胞轉染 在24孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)鴨胚成纖維細胞(DEF)或鴨胚腎細胞(DK),待95%細胞鋪滿孔底時,按說明書進行脂質體介導法轉染。將適量DNA及脂質體分別溶于一定量的OPTIMEM無血清營養(yǎng)液中,將兩者混勻,室溫作用20 min,形成脂質體復合物,加入以無血清MEM培養(yǎng)液洗滌3次后細胞單層,37℃靜置培養(yǎng)6 h后換MEM維持液。用上述方法分別轉染pTK-GFP和pTK兩種質粒,同時設沒有轉染質粒的細胞作對照。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后,在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。

2 結果

2.1 DEV強弱毒株TK基因PCR擴增和克隆

用設計的一對引物,采用PCR方法從鴨瘟強、弱毒株基因組中各擴增出一條約2 kb DNA片段,與預期結果1 995 bp相一致,其瓊脂糖電泳結果見圖1。DEV強、弱毒TK基因PCR產(chǎn)物克隆于pMD18-T載體后,重組質粒用Eco RⅠ/Hin dⅢ雙酶切鑒定,結果均切出兩條DNA條帶,一條約2 kb,是插入的TK基因,另一條約2.6 kb是載體片段。

2.2 鴨瘟病毒TK基因序列比較分析

對DEV弱毒株TK基因和U L24基因5′端982 bp序列(GenBank登錄號:EF053033)和強毒株進行比較分析,發(fā)現(xiàn)其序列完全相同。其與Gen-Bank登錄的其他3株DPV毒株TK基因序列(登錄號AY911509、四川AY 963569、四川DQ640611)相比,核苷酸的同源性分別為99.5%、99.9%和100%,推導的氨基酸序列的同源性,分別為98.6%、99.4%和100%。對DEV強、弱毒株UL24基因5′端982 bp DNA序列與GenBank收錄的DQ227739、AY 911511相比較,核苷酸同源性分別為99.8%和100%,氨基酸同源性均為100%。這說明DEV TK和U L24基因具有高度的保守性。

2.3 轉移載體的構建

2.3.1 TK基因的亞克隆和鑒定 pUC18質粒經(jīng)Eco RⅠ和Hin dⅢ雙酶切后補平末端,與p fu酶擴增的TK基因平端連接后獲得陽性克隆,重組質粒pTK經(jīng)Eco RV、Sa lⅠ雙酶切,可以獲得1.3 kb和3.3 kb兩條DNA片段,圖2顯示的瓊脂糖電泳結果與預期結果相符,表明TK基因已插入到pUC載體中,重組質粒命名為pTK。

圖1 DEV強弱毒株TK基因PCR產(chǎn)物鑒定Fig.1 PCR productsof TK gene from DEV of virulent isolate and vaccine strain

圖2 重組質粒pTK電泳Fig.2 Electrophoresisof recombinant plasmid pTK

2.3.2 GFP基因表達盒的克隆與鑒定 從質粒pAdtrack中成功擴增出約1.8 kb左右的DNA片段,經(jīng)Bam HⅠ酶切后克隆于pTK質粒Bam HⅠ和XhoⅠ位點,獲得的陽性重組質粒pTK-GFP以Eco RV酶切鑒定,切出約2 kb左右片段,DNA序列測定(測序結果未顯示)表明GFP表達盒與源序列完全一致,證明Pcmv-GFP-pA基因表達盒已經(jīng)成功克隆入pTK質粒中(圖3)。

2.4 轉染

轉移載體pTK-GFP以脂質體法轉染鴨胚成纖維細胞(DEF)和鴨腎細胞(DK)8 h后,熒光顯微鏡下觀察,可見到大量發(fā)出亮綠色熒光的細胞(見圖4A,圖4C)。圖片顯示這些細胞成多對出現(xiàn),或多個發(fā)光細胞聚集在一起。而未插入GFP表達盒的質粒pTK(見圖4B,圖4D)和未轉染質粒的細胞(圖片未顯示)沒有見到綠色熒光,表明pTK-GFP質粒攜帶的GFP基因可以在DEF和DK細胞內(nèi)得到表達。

圖3 重組質粒pTK-GFP電泳Fig.3 Electrophoresis of recombinant plasm id p TK-GFP

圖4 pTK-GFP及pTK轉染細胞后GFP表達結果Fig.4 Expression of p TK-GFP and pTK transfected in to duck embryo cells

3 討論

皰疹病毒TK基因編碼胸腺嘧啶激酶,是一種重要的毒力基因,為皰疹病毒復制的非必需基因。重組α皰疹病毒研究表明,皰疹病毒TK基因高度保守[5]。本研究通過鴨瘟強弱毒株TK基因及相鄰UL24基因克隆、測序及分析,鴨瘟病毒強毒株和弱毒株TK基因和U L24基因5′端982 bp核苷酸序列均完全一致,與其他鴨瘟病毒毒株TK基因及UL24基因5′端982 bp核苷酸序列進行比較,同源性98.6%以上,表明鴨瘟病毒TK基因高度保守。試驗用的DEV疫苗弱毒株是強毒株通過雞胚和細胞連續(xù)傳代培育而成,說明鴨瘟病毒TK基因在致弱過程中沒有變化,鴨瘟病毒的毒力強弱與TK基因編碼序列沒有直接的關系。

目前已成功建立了多種α皰疹病毒重組病毒系統(tǒng),TK基因是構建重組皰疹病毒最常用的外源基因插入位點,國內(nèi)外多位研究者[6-8]先后構建了TK基因缺失的重組偽狂犬病、雞傳染性喉氣管炎等病毒轉移載體。鴨瘟病毒轉移載體方面的研究目前尚未見報道,本文以鴨瘟病毒TK基因作為外源基因的插入位點構建轉移載體,將為進一步獲得重組鴨瘟病毒奠定基礎。

構建病毒載體疫苗時,外源基因導入病毒基因組通常采用具有同源重組臂的轉移載體與基因組DNA同源重組實現(xiàn)。同源重組已被證實是將外源基因導入的一種十分有效的方法[9]。轉移質粒同源重組臂應該長到150 bp[10],偽狂犬病病毒轉移載體兩臂在0.8 kb～1.42 kb之間具有較高的整合效率[11-13]。本研究中所構建的鴨瘟病毒TK基因轉移載體pTK-GFP,以鴨瘟病毒疫苗弱毒株TK和UL24基因為同源整合臂,缺失了TK基因的5′端核苷酸序列,同源重組臂分別為835 bp和840 bp,利于病毒在細胞內(nèi)的重組。

CMV啟動子是一種強啟動子,在多種真核細胞中均能啟動mRNA的轉錄,表達效率高[14-17]。本研究中所構建的鴨瘟病毒TK基因轉移載體,攜帶綠色熒光蛋白真核表達盒,轉染DEFs和DK細胞,GFP均可得到有效的表達,表明CMV啟動子為鴨源細胞轉錄因子所識別,可以作為啟動子應用于鴨重組病毒的構建。GFP可在異源組織中表達并產(chǎn)生熒光,近年來成為生物化學和分子生物學中廣泛應用的標記物[18]。GFP作為一種基因報告分子,對細胞沒有傷害性,可應用于活體,及時的檢測基因表達。鴨瘟病毒轉移載體以GFP作為篩選標記,方便病毒重組方法的建立和重組病毒的篩選。

鴨瘟病毒作為水禽應用最廣泛的疫苗,作為一種皰疹病毒,DEV可以成為一種良好的疫苗載體,鴨瘟病毒TK基因轉移載體的成功構建,將為進一步開展鴨瘟病毒載體的研究和構建具有遺傳標記的鴨瘟疫苗奠定了基礎。

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