趙 欣，蒲小平，肖衛(wèi)忠

(1.天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室(北京大學)，2.北京大學藥學院分子與細胞藥理學系，3.北京大學第三醫(yī)院，北京 100191)

患者血清在臨床上較容易獲得，且蘊含著重要的生物學信息。因此對患者血清中蛋白質(zhì)表達變化的研究，對于發(fā)現(xiàn)疾病特異性的生物標記物以及藥物干預、疾病相關的關鍵蛋白具有重要意義［1］。血清蛋白質(zhì)組學是指研究選定目標人群的血清中表達的全部蛋白質(zhì)，尋找其差異蛋白質(zhì)，鑒定藥物干預疾病或疾病相關的蛋白質(zhì)，進而研究其結(jié)構(gòu)和功能。它是尋找疾病生物標記物的最有效手段之一。生物標記物已經(jīng)成為基礎研究、藥物研發(fā)、臨床檢驗等方面的主力軍。檢查幾種疾病特異性的生物標志物，對于疾病的鑒定、早期診斷及預防、治療過程中的監(jiān)控可能起到幫助作用。此外，通過血清蛋白質(zhì)組學實驗技術，還可以進行疾病發(fā)病機制的探討以及藥物治療靶點的篩選。因此，血清蛋白質(zhì)組學正是實用的技術手段之一，其結(jié)果將為闡明藥物治療疾病的機制以及臨床的診斷提供重要的實驗依據(jù)和理論基礎。

目前，血清蛋白質(zhì)組學的研究方法較多采用雙向電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)聯(lián)合生物質(zhì)譜技術，但由于血清樣本的特有性質(zhì)使得2-DE分辨率較低，許多低豐度蛋白信息丟失。為此，我們對血清2-DE的多種實驗條件進行了優(yōu)化，以期建立重復性更好、分辨率更高的血清2-DE實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑血清樣本取自北京大學第三醫(yī)院神經(jīng)科。CHAPS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等為Sigma公司產(chǎn)品。尿素、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)為Merck公司產(chǎn)品。固相pH梯度干膠條(pH 4～7，17 cm)和兩性電解質(zhì)等其他雙向電泳試劑均購自Bio-Rad公司。

1.2 儀器等電聚焦儀(Protean?IEF System)，垂直電泳系統(tǒng)(Protean?Ⅱ xi cell)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 血清收集 血液樣本均由專業(yè)人員由靜脈穿刺獲得。抽取血液后，立即以1 000×g離心10 min，分離血清。血清樣品分裝后儲存于－80℃冰箱備用。

1.3.2 血清中高豐度蛋白的去除 為獲得分離度較好的血清2-DE蛋白表達圖譜，在2-DE進行前，先去除血清中的白蛋白，用文獻［2］的方法進行優(yōu)化。首先用預冷的含有10%(W/V)三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)的丙酮沉淀蛋白，混合物在－20℃條件下放置90 min。之后，在4℃，15 000×g離心20 min。棄去上清，加入預冷丙酮清洗沉淀，充分混勻后，在冰上放置15 min，之后再次4℃，15 000×g離心20 min，棄去上清。再重復此步驟3次。凍干蛋白質(zhì)沉淀后用含有蛋白酶抑制劑混合物的上樣緩沖液(7 M urea，40 mmol·L－1Tris，pH 7.4，65 mmol·L－1DTT，2%CHAPS)溶解該沉淀蛋白作為2-DE上樣樣品。

1.3.3 雙向電泳 樣品用Bradford法定量試劑盒(普利來公司)定量后上樣。2-DE按文獻［3］報道的方法稍做改進進行。取含蛋白質(zhì)800 μg的樣品，于50 V電壓下主動水化16 h。升壓程序依次為250 V線性升壓30 min，1 000 V快速升壓1 h，10 000 V線性升壓5 h，10 000 V快速升壓至70 000 V·h。等電聚焦結(jié)束之后，進行膠條平衡。然后以60 mA恒流進行分離膠濃度為12.5%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.3.4 硝酸銀染色 染色前用固定液(50%甲醇，10%冰醋酸)固定過夜。之后，凝膠在敏化液(30 mmol·L－1K3［Fe(CN)6］和 30 mmol·L－1Na2S2O3)中敏化 2 min，去離子水洗膠4次，每次10 min。用銀氨染液染膠15 min，染液配制方法參照伯樂公司雙向電泳技術手冊，為:0.36%氫氧化鈉105 ml加入30%氨水8.5 ml，然后加入20%硝酸銀 20 ml(逐滴加入)，最終定容至500 ml，臨用前新鮮配制。染膠后用去離子水洗膠2次，每次5 min，然后顯色液(5 mg·L－1檸檬酸、9.5 mg·L－1甲醛)顯色至理想程度，用1%冰醋酸終止顯色。染色后用凝膠成像系統(tǒng)獲取雙向電泳圖譜。

1.3.5 蛋白質(zhì)鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索 從雙向電泳凝膠上切下蛋白蛋白質(zhì)斑點，置于0.5 ml的Eppendorf管中，按文獻［4－5］的方法處理樣品。MS/MS質(zhì)譜分析在美國Waters公司的Micromass ESI-Q-TOF Ultima Global質(zhì)譜儀上進行。根據(jù)得到的信息，利用因特網(wǎng)上Mascot search engine檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫(http://www.matrixscience.com)，尋找匹配的蛋白質(zhì)，檢索參數(shù)設置:物種為人類(Homo Sapian)，酶為胰蛋白酶(trypsin)，單同位素質(zhì)量(Monoisotopic)，肽段質(zhì)量容忍偏差(peptides mass tolerance)±1 u，碎片離子質(zhì)量容忍偏差(fragmentions mass tolerance)±0.2 u，最大胰酶漏切位點數(shù)(max missed cleavage)為1。

2 結(jié)果

2.1 血清高豐度蛋白去除實驗在文獻［1］的描述的方法基礎上進行，主要優(yōu)化用預冷丙酮清洗TCA/丙酮沉淀下來的蛋白質(zhì)沉淀的次數(shù)。清洗不同次數(shù)(1～6次)后進行SDSPAGE電泳后的結(jié)果見Fig 1。SDS-PAGE采用12.5%的凝膠，染色方法為考馬斯亮藍染色。結(jié)果顯示，用預冷丙酮洗蛋白沉淀至少4次，才能使TCA的殘留酸性不致明顯影響電泳結(jié)果，因此，用預冷丙酮洗蛋白沉淀4次為最佳實驗方案。

Fig 1 2-DE maps of human serum dealt with different wash times of acetone after precipitation

2.2 硝酸銀染色方法的優(yōu)化為得到更為清晰的2-DE圖譜，我們對硝酸銀染色方法也進行了改進。根據(jù)伯樂公司雙向電泳技術手冊中的硝酸銀染色方法進行染色，效果不理想，而且染色速度較慢，顯現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點較少，因此，我們在此方法的基礎上，加入了敏化步驟，結(jié)果見Fig 2。圖中圈出的區(qū)域即為蛋白斑點染色明顯改進區(qū)域。Fig 2A為沒有敏化步驟的染色方法得到的結(jié)果，蛋白質(zhì)斑點數(shù)目較少，背景較高;Fig 2B為加入了敏化步驟的染色方法，蛋白質(zhì)斑點數(shù)目明顯增多，且背景有所降低，對比度比較好，更有利于后期的軟件分析以及差異蛋白質(zhì)斑點的比對和尋找。

為驗證這種敏化步驟不會對后續(xù)的生物質(zhì)譜分析產(chǎn)生影響，我們對染色后凝膠上的一個蛋白質(zhì)斑點進行了質(zhì)譜分析，得到其多肽序列信息見Fig 3A。根據(jù)所得肽段信息，通過Mascot search engine檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫，查詢與之相匹配的蛋白，結(jié)果為β-2-糖蛋白1(beta-2-glycoprotein 1)，詳細肽段匹配情況見Fig 3B。結(jié)果可見，本文所述優(yōu)化的硝酸銀染色方法中敏化步驟的引入并不會影響到后續(xù)的生物質(zhì)譜分析，我們應用該方法進行的其它血清蛋白質(zhì)組學的研究(資料未顯示)也表明，這是一種質(zhì)譜兼容的并且具有更高靈敏度和信噪比的硝酸銀染色方法。

3 討論

目前，蛋白質(zhì)組學技術已經(jīng)廣泛應用于人類疾病相關機制的研究，并且經(jīng)常用于差異表達蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和生物標記物的篩選。應用蛋白質(zhì)組學方法對血清中各種蛋白質(zhì)的變化情況進行研究，可以為疾病病理機制的探討、疾病特異生物標記物的尋找以及新藥物靶點的發(fā)現(xiàn)提供大量的重要生物信息，具有重要的理論和實際意義。

Fig 2 2-DE maps stained by different methods of silver nitrate staining

Fig 3 MS analysis and identification of the protein spot

蛋白質(zhì)組學研究最經(jīng)典的技術路線為電泳技術和質(zhì)譜技術的聯(lián)用。雖然近年來蛋白質(zhì)組學技術的發(fā)展迅速，很多新的技術方法不斷涌現(xiàn)，如:同位素親和標簽、多維高效液相色譜以及生物芯片等，但是雙向電泳和質(zhì)譜技術聯(lián)用進行分離和鑒定蛋白質(zhì)仍然是蛋白質(zhì)組學相關研究最基本和最主要的技術手段。這種方法適用于大多數(shù)樣本，包括細胞(如原代培養(yǎng)細胞或各種細胞系)、組織(如肝臟、腦、腎等)、體液(如血清、腦脊液、尿液)等。但利用雙向電泳的方法分離血清蛋白質(zhì)時，由于白蛋白、IgG等高豐度蛋白的干擾，許多重要的低豐度蛋白不能被分離出來，所得到的血清蛋白圖譜分辨率較低，效果不理想，重復性和穩(wěn)定性也較差［6］。尋找適用于血清樣本的雙向電泳實驗方法一直是相關領域研究的難點問題。因此，為得到分辨率更高、重復性更好的血清雙向電泳技術方案，憑借多年來在蛋白質(zhì)組學方面的實驗積累［7～9］，我們對樣品預處理方案和硝酸銀染色方法等進行了優(yōu)化，期望得到更為理想的血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。

在血清樣品預處理實驗中，我們發(fā)現(xiàn)TCA/丙酮用于血清樣本中白蛋白的去除不僅效果較好，而且更為經(jīng)濟，其處理結(jié)果的關鍵就在于去除TCA酸性對電泳實驗影響的同時盡少的損失需要保留的蛋白。因此，丙酮洗脫蛋白沉淀的次數(shù)尤為關鍵。通過實驗，我們發(fā)現(xiàn)4次是使TCA酸性不對后續(xù)電泳產(chǎn)生明顯影響的最少清洗次數(shù)，為較為理想的方案。在硝酸銀染色方面，我們希望得到一種靈敏度和信噪比更高且能夠兼容質(zhì)譜分析的染色方法，以適用于血清樣本的蛋白質(zhì)組學研究。通過敏化步驟的加入，這一目的得以實現(xiàn)，蛋白質(zhì)斑點明顯增多，同時背景有所降低，且不會影響后續(xù)的質(zhì)譜分析。此外，這種方法顯色速度適中，染色效果重復性好，使得硝酸銀染色尤其是在大型凝膠實驗中的染色程度能夠更好的被控制。

總之，本研究通過對2-DE的血清樣品預處理方案和硝酸銀染色方法等環(huán)節(jié)的不斷調(diào)整和優(yōu)化，建立了適合于血清樣本的2-DE實驗技術方案，結(jié)果較為穩(wěn)定，具有高分辨率和很好的重復性，對于相關血清蛋白質(zhì)組學研究具有良好的參考價值。

［1］ Anderson N L，Anderson N G.The human plasma proteome:history，character，and diagnostic prospects［J］.Mol Cell Proteomics，2002，1(11):845 －67.

［2］ Chen Y Y，Lin S Y，Yeh Y Y，et al.A modified protein precipitation procedure for efficient removal of albumin from serum［J］.Electrophoresis，2005，26(11):2117 －27.

［3］ Langen H，Roder D，Juranville J F，F(xiàn)ountoulakis M.Effect of protein application mode and acrylamide concentration on the resolution of protein spots separated by two-dimensional gel electrophoresis［J］.Electrophoresis，1997，18:2085 －90.

［4］ Gharahdaghi F，Weinberg C R，Meagher D A，et al.Mass spectrometric identification of proteins from silver-stained polyacrylamide gel:a method for the removal of silver ions to enhance sensitivity［J］.Electrophoresis，1999，20:601 －5.

［5］ Fernandez J，Gharahdaghi F，Mische S M.Routine identification of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)gels or polyvinyl difluoride membranes using matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)［J］.Electrophoresis，1998，19:1036 －45.

［6］ 李雪華，李 欣，丁彥青.血清蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術的建立［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2004，14(11):95 －9.

［6］ Li X H，Li X，Ding Y Q.Establishment of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis for serum proteomics［J］.China J Modern Med，2004，14(11):95 －9.

［7］ Zhao X，Li Q，Zhao L，Pu X P.Proteome analysis of substantia nigra and striatal tissue in the mouse MPTP model of Parkinson's disease［J］.Proteomics-Clin Appl，2007，1(12):1559 －69.

［8］ 趙 欣，蒲小平，耿興超.松果菊苷對MPTP致帕金森病小鼠模型影響的蛋白質(zhì)組學研究［J］.中國藥理學通報，2008，24(1):28－32.

［8］ Zhao X，Pu X P，Geng X C.Effects of echinacoside on protein expression from substantia nigra and striatal tissue in mouse MPTP model of Parkinsons disease by using 2-dimensional electrophoresis analysis［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):28 －32.

［9］ 趙 欣，蒲小平.蛋白質(zhì)組學在藥物研究中的應用［J］.中國藥理學通報，2009，25(8):988 －91.

［9］ Zhao X，Pu X P.The application of proteomics technology in drug study［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(8):988 －91.