張大雷，楊 蓓，吳 磊，鄒 挺

(南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西南昌 330006)

人參皂苷(Ginsenosides，GS)是人參的主要生物活性成分，具有增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心血管系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗衰老、抗癌等多種藥理學(xué)作用［1－4］。我們以前的研究表明GS可通過(guò)PKC介導(dǎo)的信號(hào)途徑促進(jìn)小鼠精原細(xì)胞的增殖［5］。然而精子發(fā)生的生理過(guò)程受到多種外源因素的調(diào)控，其中過(guò)多的活性氧能夠?qū)е律臣?xì)胞氧化損傷，破壞精子質(zhì)膜的流動(dòng)性，引起DNA損傷和精子發(fā)生異常，從而使生精功能受損及精子質(zhì)量下降，并進(jìn)一步引起胚胎發(fā)育損傷［6－7］。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠生殖細(xì)胞－體細(xì)胞無(wú)血清共培養(yǎng)模型和活性氧系統(tǒng)次黃嘌呤(hypoxanthine，HX)/黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)研究GS對(duì)小鼠精原細(xì)胞氧化損傷的緩解作用，為男性生殖健康保護(hù)探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 生殖細(xì)胞分離和培養(yǎng)ICR乳鼠由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):0319602。頸椎脫臼法處死出生后6 d的小鼠，分離曲細(xì)精管，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)和培養(yǎng)液清洗，將組織剪碎，用1 g·L－1膠原酶(Gibco-BRL)消化2次后過(guò)濾，培養(yǎng)液離心洗滌細(xì)胞3次后經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染料排除法計(jì)算細(xì)胞活率。細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM培養(yǎng)液，其中添加 1.75 mmol·L－1Hepes、2 mmol·L－1谷氨酰胺、10 mg·L－1胰島素、5 mg·L－1轉(zhuǎn)鐵蛋白和 0.03 μmol·L－1亞硒酸鈉(Sigma)。

1.2 藥物處理在生殖細(xì)胞培養(yǎng)的同時(shí)加入GS(0.1 ～10 mg·L－1)和 HX/XO(10 μmol·L－1，2.5 IU·L－1)單獨(dú)或聯(lián)合處理。對(duì)照組僅添加培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱。每個(gè)處理4孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè)采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測(cè)定生殖細(xì)胞活性。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入MTT(最終濃度為0.25 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸除培養(yǎng)液，每孔加入150 μl的DMSO溶解紫色顆粒，用酶標(biāo)儀測(cè)570 nm下的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察在倒置相差顯微鏡(Olympus，TX100)下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)變化。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用顯微數(shù)字成像系統(tǒng)(Pixera Pro 150ES)拍照。

1.5 MDA生成、SOD活性和GSH含量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定培養(yǎng)液中MDA的生成量;采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD活性;采用二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定GSH含量。使用MDA、SOD和GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所)，操作過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)分析所得數(shù)據(jù)用±s表示，采用SAS 6.12軟件中GLM過(guò)程進(jìn)行方差分析及Duncan's多重分析比較。

2 結(jié)果

2.1 GS和HX/XO對(duì)精原細(xì)胞存活的影響生殖細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，與對(duì)照組相比，HX/XO明顯抑制了精原細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞活性明顯降低(P＜0.05)，而GS(10 mg·L－1)可促進(jìn)精原細(xì)胞的生長(zhǎng)(P＜0.05)。此外，GS(10 mg·L－1)可緩解HX/XO引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制(P＜0.05)，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Effects of GS and HX/XO on spermatogonial viability(±s，n=4)

2.2 GS和HX/XO處理后精原細(xì)胞的形態(tài)變化與對(duì)照組相比，HX/XO對(duì)生殖細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化并出現(xiàn)死亡，大量的細(xì)胞碎片釋放到培養(yǎng)液中，貼壁的生殖細(xì)胞數(shù)目減少。GS(10 mg·L－1)緩解了HX/XO系統(tǒng)引起的細(xì)胞氧化損傷，細(xì)胞形態(tài)完整，貼壁的生殖細(xì)胞數(shù)目增多，見(jiàn)Fig 2。

Fig 2 Morphological changes of mouse testicular germ cells after treatments of chemicals for 24 h

2.3 GS對(duì)HX/XO系統(tǒng)引起的精原細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用HX/XO對(duì)精原細(xì)胞具有明顯的氧化損傷作用，與對(duì)照組相比，HX/XO處理組的MDA生成升高，SOD活性和GSH水平下降(P＜0.05)。然而，GS(10 mg·L－1)可明顯緩解HX/XO引起的細(xì)胞氧化損傷，MDA濃度明顯降低，而SOD活性和GSH水平明顯升高(P＜0.05)，見(jiàn)Fig 3。

Fig 3 Determination of attenuating effects of GS on germ cell oxidative damage by MDA formation，SOD activity(B)and GSH level(C)(±s，n=4)

3 討論

哺乳動(dòng)物睪丸生殖細(xì)胞對(duì)細(xì)胞內(nèi)外的氧化狀態(tài)高度敏感，極易受到自由基的損傷。SOD和GSH是細(xì)胞內(nèi)消除活性氧的抗氧化防御體系，能夠清除自由基，減少細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物的生成，從而防止細(xì)胞受到氧化損傷。MDA可以反映脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明HX/XO處理后通過(guò)產(chǎn)生活性氧破壞生殖細(xì)胞的完整性，使脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成量增加，引起SOD活性和GSH水平降低，從而破壞細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶防御系統(tǒng)，導(dǎo)致小鼠精原細(xì)胞氧化損傷。

GS具有明顯的抗氧化作用，可通過(guò)抑制氧自由基的過(guò)度產(chǎn)生減輕由缺血/再灌注引起的組織損傷［8］，并提高膽堿能系統(tǒng)的抗氧化能力從而改善老齡大鼠的認(rèn)知能力［9］。許立等［10］的研究也表明GS可增強(qiáng)睪丸組織的抗氧化能力，從而對(duì)♂小鼠生殖功能具有保護(hù)和改善作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明GS能夠使精原細(xì)胞內(nèi)SOD活性和GSH水平以及MDA的生成量恢復(fù)到正常水平，說(shuō)明GS可以通過(guò)抗氧化作用阻止生殖細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基并維持正常的抗氧化體系，進(jìn)而保護(hù)活性氧引起的生殖細(xì)胞氧化損傷。

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