王 莉，賈彥波，陳 方，王清清，趙 陽，馬百平，陳志武，宋海峰

(1.安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，安徽合肥 230032;2.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所藥理毒理研究室;3.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所生物技術研究室，北京 100850)

化合物知母皂苷B-Ⅱ是從中藥材知母中提取的含有兩個糖鏈的水溶性甾體皂苷類化合物，具有擴張血管、增加腦血流量、清除自由基以及促進胚胎大鼠海馬神經(jīng)細胞增殖等活性，同時具有明顯改善擬癡呆模型動物的學習記憶功能的作用［1－3］。前期藥理學研究表明此化合物在抗老年癡呆方面具有良好前景。為闡明其藥代動力學特性，需建立針對生物樣品中知母皂苷B-Ⅱ的定量分析方法。本研究根據(jù)知母皂苷B-Ⅱ結(jié)構(gòu)特點及理化性質(zhì)建立了一種快速、專屬、靈敏和準確的液質(zhì)聯(lián)用法(HPLCMS/MS)，用以檢測大鼠血漿樣品中知母皂苷B-Ⅱ的含量。按照藥代動力學定量分析方法驗證要求，對上述方法進行了嚴格的方法學確證，并將此方法應用于知母皂苷B-Ⅱ臨床前藥代動力學研究中。

1 材料

1.1 儀器日本島津(SHIMADZU)公司20AD高效液相色譜系統(tǒng)(DGU-20A3在線真空脫氣機，LC-20AD泵，SIL-20AC自動進樣器，CBM-20A控制器，CTO-20A色譜柱柱溫箱)，美國AB公司API 4000三重四極桿質(zhì)譜儀配備ESI源，液相和質(zhì)譜的儀器控制以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理均由AB公司Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)完成。

1.2 試劑受試品化合物知母皂苷B-Ⅱ為白色粉末，批號:20031112，純度 ＞90%，常溫保存。內(nèi)標(IS)為ParisaponinⅠ(重樓皂苷Ⅰ)，批號:090215，純度＞95%(均為軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所生物技術研究室提供)，結(jié)構(gòu)見Fig 1、2。實驗用乙腈為色譜純，購自美國Fisher公司。乙酸銨為分析純，為北京化劑公司。實驗用水為經(jīng)Millipore Simplicity 185純水儀產(chǎn)超純水。

Fig 1 The structure formula of Timosaponin B-Ⅱ

1.3 動物健康SD大鼠6只(清潔級)，♂♀各半，2月齡，體質(zhì)量(202±8)g，由北京軍事醫(yī)學科學院動物中心提供(許可證號 SCXK［軍］2002-001)。單籠飼養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律照明，實驗期間自由飲水。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為 GRACE公司Alltima HP C18柱(2.1 mm ×50 mm，5 μm)。分析流動相為乙腈 ∶1 mmol·L－1乙酸銨溶液(30 ∶70，V ∶V)，流速 0.2 ml·min－1，柱溫為室溫。

Fig 2 The structure formula of Parisaponin I

2.1.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源;檢測方式為負離子多反應監(jiān)測(MRM);離子噴射電壓為4500 V;溫度為500℃;源內(nèi)氣體1(GS1，N2)流速為30 psi;氣體2(GS2，N2)流速為45 psi;氣簾氣體(N2)壓力為10 psi;DP電壓為145 V;碰撞氣(N2)壓力為6 psi?；衔镏冈碥誃-Ⅱ用于定性分析離子對m/z:919.5→595.4，定量分析的離子對為m/z:919.4→757.4;IS用于定性分析離子對m/z:1033.5→755.3，定量離子對為m/z:1033.5→901.4。

2.2 標準品和QC樣品的制備精密稱取受試品和 IS粉末，去離子水溶解，定容至 1 μg·L－1，制備成儲備液，所有儲備液均保存在4℃冰箱備用。工作曲線用SD大鼠空白血漿作基質(zhì)，將標準品儲備溶液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為 5、10、20、50、125、500 和 2 000 μg·L－1的血漿樣品。同時用另一份標準品儲備液同法制備質(zhì)量濃度分別為12.5、100、1500 μg·L－1的 3 個低、中、高 QC 樣品。

2.3 樣品前處理采用蛋白沉淀法處理血漿樣品，將樣品混勻后吸取血漿樣品30 μl入EP管中，再加10 μl 100 μg·L－1IS(用85%乙腈逐級稀釋IS 儲備液)以及90 μl體積分數(shù)為85%的冰乙腈，渦旋混勻后12 000 r·min－1離心6 min，吸取上清液30 μl，加入 90 μl 1 mmol·L－1乙酸銨溶液后混勻，置于進樣瓶，進樣量20 μl進行HPLC-MS/MS分析。

2.4 大鼠藥代動力學研究中的應用SD大鼠按每只80 mg·kg－1的劑量灌胃，給藥后于15、30 min，1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h 經(jīng)大鼠眼底靜脈叢采血約400 μl，加入含有檸檬酸鈉抗凝管中輕搖混勻，4 000 r·min－1離心 10 min，血漿樣品保存于－80℃待測。運用WinNolin 5.2程序采用非房室模型計算和 Tmax等參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 標準曲線建立采用Analyst 1.5軟件進行峰面積自動積分和標準曲線擬合，權重因子1/X。以測得受試標準品峰面積與IS峰面積比值為縱坐標(Y)對血樣質(zhì)量濃度(X)做線性回歸。標準曲線回歸方程為 ^Y=0.019 6 X+0.157(r=0.999 6)。線性范圍 5 ～2 000 μg·L－1，最低定量下限是 5 μg·L－1。

3.2 方法學驗證依據(jù)FDA關于分析方法驗證指導原則［2］進行方法學驗證，分別對方法的專屬性、精密度與準確度、基質(zhì)效應、稀釋線性以及穩(wěn)定性等方面進行考察。

3.2.1 方法的專屬性和特異性 分別取大鼠空白血漿，空白血漿加標準品和IS樣品，以及大鼠給藥后的血漿樣品按照步驟“2.3”項下方法操作處理，觀察大鼠血漿中有無干擾物以及方法的專屬性和特異性。Fig 3A～C，表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾樣品的測定，知母皂苷B-Ⅱ和IS在當前色譜條件下峰形良好，單個樣品分析時間3 min。

Fig 3 The selectivity and specificity of method

3.2.1 精密度與準確度 分別用大鼠血漿配制低、中、高3個濃度的QC樣品，每個濃度進行6樣本分析，連續(xù)測定3 d，根據(jù)當日隨行標曲，分別計算QC樣品的測得濃度，以其標示濃度為參照，按方差分析方法計算測定方法的準確度和日內(nèi)、日間精密度。Tab 1表明日內(nèi)和日間精密度均＜15%，準確度在－8.6% ～7.5%，均符合生物樣品分析的要求。

3.2.3 基質(zhì)效應、回收率 配制A、B、C和D 4套QC樣品，比較響應值之比獲得基質(zhì)效應和回收率數(shù)據(jù)。Set A:空白大鼠血漿乙腈沉淀后的上清液配制低、中、高3個濃度的 QC樣品，各取30 μl，加入 IS(100 μg·L－1)10 μl，再加入90 μl 1 mmol·L－1乙酸銨混勻后進樣。

Tab 1 Results of precision and accuracy for Timosaponin B-Ⅱin rat plasma( ± s，n=6)

Tab 1 Results of precision and accuracy for Timosaponin B-Ⅱin rat plasma( ± s，n=6)

a:RE=［Measured concentration］/［Spiked concentration］×100% －1

Spiked concentration/μg·L－1 Intra-precision Measured concentration/μg·L－1 RSD/% REa /%Inter-precision Measured concentration/μg·L－1 RSD/% REa /%12.5 11.9 ±1.3 10.9 －4.8 12.0 ±1.2 10.3 －3.7 100 98.9 ±7.8 8.0 －1.1 101.7 ±6.7 6.6 1.7 1500 1628.3 ±47.1 2.9 －8.6 1612.2 ±115.2 6.6 7.5

Tab 2 Results of matrix effects for Timosaponin B-Ⅱand IS in rat plasma(n=6)

Tab 3 The recoveries of Timosaponin B-Ⅱand IS in rat plasma(n=6)

Set B:空白大鼠血漿，加入 IS(100 μg·L－1)10 μl，取乙腈沉淀后的上清液配制低、中、高濃度的QC樣品。各取 30 μl，加入 10 μl水溶液，再加入 90 μl乙酸銨混勻后進樣。

Set C:按“2.2”項中方法配制大鼠血漿的低、中、高3濃度樣品，加入10 μl水溶液，各取乙腈沉淀后30 μl上清液，加入 10 μl內(nèi)標液，再加入 90 μl乙酸銨混勻后進樣。

Set D:用流動相分別配制3個濃度QC樣品，取QC 樣品上清液 30 μl，加入 10 μl內(nèi)標液和 90 μl乙酸銨混勻后進樣。

大鼠空白血漿來源于6個不同個體，每個濃度平行測定6個樣品。

知母皂苷B-Ⅱ的基質(zhì)效應/%=Set A(知母皂苷B-Ⅱ/IS)平均值/Set D(知母皂苷B-Ⅱ/IS)平均值 ×100%。

IS的基質(zhì)效應/%=Set A(IS/知母皂苷B-Ⅱ)平均值/Set D(IS/知母皂苷B-Ⅱ)平均值 ×100%。

知母皂苷B-Ⅱ回收率/%=Set C平均信號比(知母皂苷B-Ⅱ/IS)/Set A平均信號比(知母皂苷B-Ⅱ/IS)×100%。

IS的回收率/%=Set B平均信號比(IS/知母皂苷B-Ⅱ)/Set A平均信號比(IS/知母皂苷B-Ⅱ)×100%。

結(jié)果顯示低、中、高3個QC濃度中知母皂苷B-Ⅱ在大鼠血漿中基質(zhì)效應分別是96%、82%、87%，同時IS基質(zhì)效應分別是122%、117%和106%，知母皂苷B-Ⅱ和IS的CV分別小于5.44%和5.18%。結(jié)果顯示知母皂苷B-Ⅱ和IS在大鼠血漿中均不存在明顯的基質(zhì)效應［5］;乙腈沉淀蛋白方法獲得知母皂苷B-Ⅱ提取回收率高、中、低濃度分別為91%、112%、107%(n=6)，IS提取回收率高、中、低濃度分別為116%、98%、102%(n=6)，回收率均較高。

3.2.4 稀釋線性 將高濃度樣品分別逐級稀釋20倍，100倍和500倍到低、中、高3個濃度QC樣品。測定計算質(zhì)量濃度與加入質(zhì)量濃度之間的平均相對誤差和每個級別QC的CV%均＜15%，符合方法學要求，結(jié)果見Tab 4。

3.2.5 穩(wěn)定性考察 配制低、中、高3個濃度的QC血漿樣品，每個濃度各3份，分別考察上述樣本在4℃保存12 h、反復凍融3次以及－80℃冷凍保存2 mon的穩(wěn)定性。Tab 5表明知母皂苷B-Ⅱ血漿樣品在4℃保存12 h穩(wěn)定，經(jīng)過3次反復凍融后不受影響，長期穩(wěn)定性實驗表明知母皂苷B-Ⅱ血漿樣品在－80℃保存60 d仍然穩(wěn)定，足夠覆蓋樣品從采集到測樣的時間。

Tab 4 Result for linearity to dilute of Timosaponin B-Ⅱ(n=6)

Tab 5 Result for stability of Timosaponin B-Ⅱ in different conditions( ± s，n=3)

Tab 5 Result for stability of Timosaponin B-Ⅱ in different conditions( ± s，n=3)

Stability at 4℃(24 h)Freeze/thaw(3cycles)Long-term freeze(2 mon)Spiked concent/μg·L －1Measured concentration/μg·L －1CV/%Measured concentration/μg·L －1CV/%Measured concentration/μg·L －1CV/%12.5 12.1 ±1.2 9.8 13.4 ±0.9 6.6 12.2 ±1.6 13.1 100 88.9 ±8.7 9.8 98.2 ±8.1 8.2 86.0 ±4.5 5.2 1500 1447 ±140 10 1616.7 ±58.2 3.6 1367 ±105 8

3.3 藥代動力學研究本方法成功應用口服80 mg·kg－1知母皂苷B-Ⅱ后12 h后血藥濃度測定。平均藥物濃度－時間曲線見Fig 4，主要藥代動力學評價參數(shù)見Tab 6。從圖和表中可以看出，SD大鼠在2.5 h血藥濃度達到峰值，消除速率常數(shù)是0.5，平均滯留時間是4.3 h，在8 h后藥物濃度均低于最低定量下限。

Fig 4 Plasma concentration-time curve after oral administration of Timosaponin B-Ⅱ in rat at a dose of 80 mg·kg－1

Tab 6 PK parameter for po administration of Timosaponin B-Ⅱ to rat at a dose of 80 mg·kg －1(n=6)

4 討論

4.1 分析條件知母皂苷B-Ⅱ在酸性或者加熱條件下容易環(huán)合成次生苷［6］，同時其在甲醇體系中C-22的羥基與C-22甲氧基易互變，因此對知母皂苷B-Ⅱ分析我們采用乙腈與不同比例醋酸銨進行分析條件優(yōu)化。選擇最佳峰型和最大響應值豐度，確定分析用流動相為乙腈∶1 mmol·L－1乙酸銨溶液(30∶70，V ∶V)。文獻報道［7］選用 Agilent Zorbax SBC18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)可以獲得較好峰型和分離度，但是分析時間長，本實驗選用Alltima HP C18 柱(2.1 mm ×50 mm，5 μm)，不僅峰形良好且縮短了分析時間，知母皂苷B-Ⅱ保留時間是1.78 min，IS保留時間是1.96 min，整個分析周期僅為3 min。

對知母皂苷B-Ⅱ和IS分別在正、負離子模式全掃描發(fā)現(xiàn)在負離子模式下響應值高且穩(wěn)定，它們各自的母離子m/z［M-H］919.4;m/z 1033.5。通過對碰撞能量等條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)知母皂苷B-Ⅱ兩個離子對m/z:919.5→595.4;m/z:919.4→757.4，其中 m/z:919.4→757.4和IS離子對 m/z:1033.5→901.4響應值較高，選此離子對作為定量分析。

4.2 樣品前處理雖然實驗和文獻報道定量下限都是5 μg·L－1，但是本實驗樣品前處理僅需血漿樣品 30 μl，不及文獻報道［8］血漿用量的 1/3，因此實際上本研究建立的方法更加靈敏。在小動物連續(xù)采血的PK(pharmacokinetic)研究中也有利于動物保持良好的生理狀態(tài)，更加客觀地反映藥物PK特征。

4.3 方法學驗證為了保證數(shù)據(jù)可靠，本研究在方法學驗證階段參考FDA關于分析方法驗證指導原則［4］和相關文獻［5］選用不同個體大鼠血漿考察方法精密度與準確度、基質(zhì)效應和回收率，進行嚴格的方法學確證。尤其在回收率考察方面，在SFDA要求基礎上不僅測定了整個方法效率(process efficiency，PE)，即絕對回收率，還分別考察了目標物和IS的基質(zhì)效應(matrix effect，ME)和提取回收率(recovery effect，RE)。

4.4 PK實驗大鼠口服80 mg·kg－1知母皂苷B-Ⅱ后，呈不規(guī)則的藥時曲線，這一現(xiàn)象可能是由于知母皂苷B-Ⅱ特殊的吸收性質(zhì)造成的，如存在肝腸循環(huán)、多部位吸收等因素。這一結(jié)果需要進一步實驗確證。

我們對知母皂苷B-Ⅱ在大鼠血漿定量分析方法進行改進與優(yōu)化，建立了大鼠血漿樣品中知母皂苷B-Ⅱ的HPLC-MS/MS定量分析方法，并按照FDA要求進行方法學確證，結(jié)果顯示本研究建立的HPLC-MS/MS法較文獻方法更為快速、靈敏，并能滿足知母皂苷B-Ⅱ藥物動力學的研究。

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