張建麗 王占良 高照 劉欣 張亦農(nóng)國家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

鹽酸克倫特羅（clenbuterol）化學(xué)名為2-［（叔丁氨基）甲基］-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽，商品名為克喘素、平喘素等，是一種人工合成的β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑。其藥理作用為松弛支氣管平滑肌、增加肺活量、降低氣道阻力、增強(qiáng)支氣管纖毛運(yùn)動(dòng)和促進(jìn)痰液排出，臨床上常用于防治哮喘、肺氣腫等呼吸系統(tǒng)疾?。?］。

除具有以上藥理作用外，克倫特羅還具有蛋白同化作用，因此作為興奮劑，該藥物是世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（World Anti-Doping Agency，WADA）禁止運(yùn)動(dòng)員使用的一種蛋白同化制劑［2］。近年來，鹽酸克倫特羅被非法用于飼養(yǎng)生豬，俗稱“瘦肉精”，其蛋白同化作用可促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長，降低脂肪量，并在被飼養(yǎng)動(dòng)物的肌肉組織和內(nèi)臟中殘留［1，3，4］。鹽酸克倫特羅化學(xué)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，在體內(nèi)不易被破壞分解。含有該藥的肉類經(jīng)過126℃油煎5min，只能破壞一半殘留量［5］，常規(guī)烹調(diào)對(duì)克倫特羅殘留起不到破壞作用。如果運(yùn)動(dòng)員食用了殘留鹽酸克倫特羅的豬肉或豬內(nèi)臟，甚至有可能造成尿檢陽性，這將嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)員的運(yùn)動(dòng)生涯。本實(shí)驗(yàn)從對(duì)生豬進(jìn)行不同方法定量添加鹽酸克倫特羅飼養(yǎng)開始，定量分析飼養(yǎng)的生豬各部位組織殘留的克倫特羅，接著對(duì)健康受試者進(jìn)行定量食用烹飪熟的豬肉組織的人體受試研究，最后分析總結(jié)食源性鹽酸克倫特羅造成人體尿樣興奮劑陽性的可能性，為探討運(yùn)動(dòng)員是否會(huì)由于食用鹽酸克倫特羅喂養(yǎng)過的豬肉或豬內(nèi)臟造成尿檢興奮劑陽性的可能性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

鹽酸克倫特羅對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所）；納多洛爾和甲基睪酮（Sigma公司）；高氯酸（上海金鹿化工有限公司）；氨水（北京化工廠）；甲酸（Dikma）；氫氧化鈉（北京化學(xué)試劑公司）；甲酸銨（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（Dikma）；乙腈（Dikma）；HLB固相萃取小柱（Waters）；MCX固相萃取小柱（Waters）；叔丁基甲醚（Dikma）；β-葡萄糖醛酸甙酶（Sigma）；磷酸氫二鉀（北京化學(xué)試劑公司）；磷酸二氫鉀（北京化學(xué)試劑公司）；碳酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；碳酸氫鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三甲基碘硅烷（Sigma）。

1.2 儀器及輔助設(shè)備

Agilent 1200HPLC/6130MS；AgilentZorbaxSB-C18 150mm×2.1mm×5μm；Agilent 6890GC/5973MS；IKA-T18組織勻漿機(jī)；VORTEX-2 GENIE渦旋混合器；MEGAFUGE 1.0R冷凍離心機(jī)；TECHNE氮?dú)鉂饪s儀；Waters固相萃取儀；KQ3200DE超聲波清洗儀。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

流動(dòng)相為10mmol·L-1pH3.5甲酸銨（A）和乙腈（B），洗脫梯度為0min時(shí)A90%，2min時(shí)A90%，11min時(shí)A25%；流速為0.4ml·min-1；進(jìn)樣量為20μl；掃描方式為選擇離子采集方式采集m/z 277（克倫特羅）和m/z 310（內(nèi)標(biāo)）；干燥氣流速為9L·min-1；霧化氣壓力位40psi；柱溫為40℃。

1.4 動(dòng)物受試及取樣

委托北京黎昌鈺鑫科技發(fā)展有限公司按不同劑量鹽酸克倫特羅和不同養(yǎng)殖周期專人單獨(dú)飼養(yǎng)6頭豬仔，飼養(yǎng)方式見表1。飼養(yǎng)到期后在屠宰場(chǎng)宰殺，取每頭豬前腿、后腿、里脊、腹肉、肝臟和腎臟六個(gè)部位部分組織冷藏。

表1 對(duì)豬仔進(jìn)行鹽酸克倫特羅定量受試情況

1.5 豬肌肉組織樣品的提取與凈化［6］

提?。簻?zhǔn)確稱取 10.0g樣品，加入10ml水，勻漿約1min，用高氯酸調(diào)pH值至1.0，超聲振蕩20min。取上清液于干凈試管中，殘?jiān)儆?.1mol·L-1高氯酸溶液10ml提取一次，離心，合并上清液。用12mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至4.0，此溶液待過HLB固相萃取小柱。凈化：HLB固相萃取小柱在使用前用6ml甲醇、6ml水活化。將提取液以2ml·min-1的速度過柱，棄去濾液，用5%甲醇氨2ml淋洗，小柱抽干。再用6ml甲醇洗脫。洗脫液用氮?dú)獯抵两?。?.1 mmoL·L-1高氯酸溶液3ml溶解殘?jiān)?，供MCX柱凈化用。MCX柱在使用前用3ml 5%甲醇氨、3ml甲醇、3ml水、3ml 0.1mmoL·L-1高氯酸溶液活化。將凈化后的溶液過柱，棄去濾液，依次用1ml甲醇、1ml 2%甲醇水溶液淋洗，最后用5%甲醇氨7ml洗脫，洗脫液用氮?dú)獯抵两?，?ml初始比例流動(dòng)相溶解，用于LC/MS測(cè)定。

1.6 人體受試及取樣

兩名健康男性受試者，體重分別為85kg（一號(hào)受試者）和65kg（二號(hào)受試者）。人體受試前均已簽訂《知情同意書》。對(duì)已知鹽酸克倫特羅含量的一定重量豬肉或豬肝進(jìn)行正常烹飪至熟，然后分別對(duì)兩名受試者進(jìn)行單次定量受試。受試者留取3天內(nèi)所有尿樣，在受試期間正常飲水但不能再食用其他肉制品。

1.7 尿樣的前處理

取尿樣2ml加入50μl內(nèi)標(biāo)（甲基睪酮，50ng·ml-1）甲醇溶液，加入 1ml磷酸緩沖液（pH約為 6.9），加入50μl β-葡萄糖醛酸甙酶（2500unit），55℃恒溫水浴保溫不少于60min，取出樣品冷卻至室溫，加入0.5ml堿性緩沖液（pH約為9.6），加入4ml叔丁基甲醚，振蕩萃取，離心后取上清液，55℃下氮?dú)獯蹈?，加?0μl三甲基碘硅烷，振搖后轉(zhuǎn)移至尖底小瓶中封口，70℃恒溫 30min，GC/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取回收率

取空白基質(zhì)10.0g三份，分別加入10ng·μl-1鹽酸克倫特羅對(duì)照品100μl，再分別加入10ng·μl-1內(nèi)標(biāo)50μl，按照“1.5豬肌肉組織樣品的提取與凈化［6］”進(jìn)行提取凈化后，氮?dú)獯蹈桑?ml初始比例流動(dòng)相溶解后進(jìn)行LC/MS分析，記錄克倫特羅的定量離子色譜峰面積（A1）和納多洛爾（內(nèi)標(biāo)）的定量離子色譜峰面積（AIS1）。另取相同空白基質(zhì)10.0g，按照“豬肌肉組織樣品的提取與凈化”進(jìn)行提取凈化，提取液中分別加入與上述等量的對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)，氮?dú)獯蹈桑?ml初始比例流動(dòng)相溶解后進(jìn)行LC/MS分析，記錄克倫特羅的定量離子色譜峰面積（A2）和納多洛爾（內(nèi)標(biāo)）的定量離子色譜峰面積（AIS2）。按下式計(jì)算克倫特羅分別在豬肉和豬肝中的提取回收率（E）。E（%）=（A1/AIS1）／（A2/AIS2）×100%。結(jié)果見表2。

表2 回收率結(jié)果（n=3）

2.2 受試豬肌肉組織中鹽酸克倫特羅的定量分析

分別以空白豬肉和空白豬肝為基質(zhì)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取10.0g空白豬肉6份，分別制備成含有鹽酸克倫特羅的對(duì)照品 50ng·g-1、100ng·g-1、200ng·g-1、500ng·g-1、1000ng·g-1、2000ng·g-1和100ng·g-1納多洛爾（內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品的樣品，每一濃度點(diǎn)平行做三份，按“豬肌肉組織樣品的提取與凈化”方法進(jìn)行前處理，計(jì)算克倫特羅提取離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)提取離子的峰面積的比值，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0026x+0.2205，R2=0.996，結(jié)果表明在豬肉基質(zhì)中，鹽酸克倫特羅在50ng·g-1～2000ng·g-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖1。稱取10.0g空白豬肝六份，分別制備成含有鹽酸克倫特羅對(duì)照品 500ng·g-1、1000ng·g-1、2000ng·g-1、5000ng·g-1、8000ng·g-1、10000ng·g-1和100ng·g-1納多洛爾（內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品的樣品，每一濃度點(diǎn)平行做三份，按“豬肌肉組織樣品的提取與凈化”方法進(jìn)行前處理，計(jì)算克倫特羅提取離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)提取離子的峰面積的比值，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0008x+0.5413，R2=0.9951，結(jié)果表明在豬肝基質(zhì)中，鹽酸克倫特羅在500ng·g-1～10000ng·g-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖2。

圖1 豬肉中鹽酸克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 豬肝中鹽酸克倫特羅的標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)受試六頭豬的六個(gè)部位組織克倫特羅殘留量定量分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明：（1）豬肉前腿、后腿、腹肉和里脊的克倫特羅含量無明顯差異；（2）肝臟和腎臟克倫特羅含量明顯高于前腿、后腿、腹肉和里脊；（3）從豬受試藥量與其組織中殘留藥量的關(guān)系可以得出，豬肉克倫特羅殘留量與其受試劑量及受試時(shí)間長短呈正相關(guān)。

表3 六頭豬的六個(gè)部位克倫特羅殘留量測(cè)試結(jié)果（ng·g-1）

2.3 人體受試的尿樣檢測(cè)結(jié)果（圖3～圖8）

圖3 一號(hào)受試者食用含鹽酸克倫特羅 175ng·g-1豬前腿125g后的尿排曲線

圖4 二號(hào)受試者食用含鹽酸克倫特羅 175ng·g-1豬前腿125g后的尿排曲線

圖5 一號(hào)受試者食用含鹽酸克倫特羅2467ng·g-1豬肝100g后的尿排曲線

圖6 二號(hào)受試者食用含鹽酸克倫特羅2467ng·g-1豬肝100g后的尿排曲線

圖7 一號(hào)受試者服用300μg的鹽酸克倫特羅對(duì)照品后的尿排曲線

圖8 二號(hào)受試者服用300μg的鹽酸克倫特羅對(duì)照品后的尿排曲線

為了考察食用動(dòng)物肌肉組織和直接服用對(duì)照品的尿樣代謝差別，本實(shí)驗(yàn)兩位受試者又同時(shí)服用了與豬肝中鹽酸克倫特羅等量的對(duì)照品，留取尿樣進(jìn)行檢測(cè)，具體受試信息見表4。

3 總結(jié)

從上述人體受試后的尿樣檢測(cè)結(jié)果可以得出：兩位受試者在正常飲水的情況下，如果食用豬肉制品中克倫特羅總量不超過1μg，則不會(huì)產(chǎn)生興奮劑尿檢陽性。但服用殘留一定量克倫特羅的動(dòng)物組織時(shí)，可能導(dǎo)致克倫特羅尿檢陽性。服用一定量對(duì)照品和食用等量含有克倫特羅的豬肉組織后，人體內(nèi)克倫特羅代謝無明顯差異。

表4 兩位健康受試者的受試情況

［1］徐國茂，胡翊煒，王錚，等.鹽酸克倫特羅檢測(cè)中存在的問題.廣東飼料，2007，16（3）:37-38.

［2］World Anti-Doping Agency.The 2009 prohibited list internationalstandard.http：//www.wada-ama.org/Documents/World Anti-Doping Program/WADP-Prohibited-list/WADA Prohibited List 2009 EN.pdf，2009.4-4.

［3］Dawson J.β-agonists put meat in the limelight again.Br Med J，1990，301:1238-1239.

［4］徐友宣.β2-受體激動(dòng)劑克倫特羅的藥理及濫用.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2002，21（2）:222-224.

［5］張亞林，蔡世魁.控制鹽酸克倫特羅殘留危害刻不容緩.肉品安全，2007，24（11）:19-21.

［6］Analysis of β-agonists in foods of animal origin by high performance liquid chromatography tandem massspectrometry［GB］.GB/T 21313-2007:2-3.