楊芙蓮， 聶小偉

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

刺五加系五加科植物，是我國(guó)東北地區(qū)的典型藥用植物，味辛、微苦、性溫、無(wú)毒.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，刺五加具有抗衰老、抗疲勞、抗癌及調(diào)節(jié)神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管功能以及提高機(jī)體對(duì)物理、化學(xué)、生物等有害剌激的抵抗能力等藥理作用[1,2]，此外在神經(jīng)衰弱、失眠、高血壓病、冠心病、腦梗塞、腦動(dòng)脈硬化、更年期綜合癥、血脂異常、糖尿病、風(fēng)濕病、慢性支氣管炎以及腫瘤等疾病的治療中都有一定療效[3,4].

經(jīng)深入研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮是刺五加中最重要的營(yíng)養(yǎng)保健功能因子之一，它有降脂、抗血栓、抗氧化、抗衰老、抗心率失常等作用，因而廣泛用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)，具有廣泛的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景.本研究探討了刺五加的總黃酮的提取工藝條件，采用分光光度法對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定，以期為野生刺五加的深度開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

刺五加粉：西安中藥集團(tuán)；蘆丁對(duì)照品：北京藥品生物制品研究所；亞硝酸鈉：天津市化學(xué)試劑廠；硝酸鋁：天津市頂?；た倧S；乙醚、丙酮及其它試劑均為分析純.

1.2 儀器

SORVALL RC 3B PLUS 離心機(jī)(美國(guó))；MA110電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；DK-98-1 電子恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；超聲波粉粹儀(寧波新芝科器研究所)；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-IIIA型不銹鋼臺(tái)式真空泵(鞏義市瑞的儀器設(shè)備有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波條件

超聲波參數(shù)：超聲波過(guò)程溫度為5～55 ℃，頻率25 kHz，超聲時(shí)間10 s，工作間隙時(shí)間15 s.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取120 ℃干燥至恒重的蘆丁樣品20 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇適量，置于水浴上微熱使之溶解，再加甲醇至刻度，搖勻.精確量取1 mL置于10 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻靜止，即得0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.

分別移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 mL放入1～6號(hào)10 mL容量瓶中，然后分別加入0.3 mL 5% NaNO2，搖勻，靜置6 min；再分別加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，搖勻，靜置6 min，而后又分別加入4 mL 4% NaOH，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，最后于510 nm下測(cè)定吸光度，以蒸餾水作參比液[5].

1.3.3 提取工藝流程

野生刺五加粉→過(guò)篩→稱(chēng)取一定量樣品→用一定濃度的乙醇配制溶液→超聲波提取→減壓抽濾→無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→沉淀蛋白質(zhì)、可溶性多糖→ 無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌→ 蒸發(fā)濃縮→ 恒溫干燥→ 總黃酮粗品.

1.3.4 總黃酮得率的測(cè)定方法

精確稱(chēng)取處理得到的樣品，用30%乙醇溶解后，按“繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線”的方法進(jìn)行操作，并以空白樣為參照，在510 nm處測(cè)其吸光度.根據(jù)回歸方程計(jì)算出刺五加樣品中總黃酮的得率(mg/g).

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.5 提取條件單因素試驗(yàn)

影響超聲提取野生刺五加總黃酮的因素很多，本試驗(yàn)考慮到試驗(yàn)條件的限制，在設(shè)定“1.3.1”中超聲波提取的工藝參數(shù)下，選取乙醇體積濃度、液固比、提取時(shí)間、提取功率4個(gè)影響提取效果的主要因素做單因素試驗(yàn)，以確定各因素的合適范圍.

1.3.6 超聲波輔助提取工藝正交優(yōu)化

通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定正交試驗(yàn)工藝參數(shù)的范圍，選取乙醇體積濃度、液固比、超聲時(shí)間和超聲波功率4個(gè)主要影響因素的3個(gè)合適水平進(jìn)行優(yōu)化組合.

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及線性回歸方程

圖1為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)的工作曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸得到回歸方程為y= 0.012 0+18.742x，R2=0.997 2，其中y為吸光度，x為蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL).

2.2 單因素試驗(yàn)研究

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲波提取總黃酮得率的影響

分別考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲提取總黃酮得率的影響，超聲波條件：10.000 g左右的刺五加根莖，液固比為10∶1，超聲時(shí)間為25 min，超聲功率為420 W，結(jié)果見(jiàn)圖2.

從圖2可看出，根據(jù)相似相溶原理，總黃酮易溶于極性溶劑中，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時(shí)，其得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，而乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，其得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大變化不大.綜合考慮，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)的提取效率較高.

2.2.2 液固比對(duì)超聲波提取效果的影響

分別考察不同液固比對(duì)超聲波提取總黃酮得率的影響，超聲波條件：10.000 g左右的刺五加根莖，乙醇體積濃度60%，25 min，420 W，結(jié)果見(jiàn)圖3.

由圖3可以看出，液固比對(duì)刺五加中總黃酮的提取影響較大，得率隨液固比增大而增大,可能是由于物料與試劑的接觸表面積增大的原因；但液固比太大,提取液質(zhì)量分?jǐn)?shù)則小，對(duì)總黃酮提取純化造成一定困難.從浸提效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷等方面綜合考慮，在保證一定提取率的基礎(chǔ)上選擇液固比較小的比值.

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲波提取總黃酮得率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)超聲波提取效果的影響

分別考察不同超聲波時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響，超聲波條件：10.000 g左右的刺五加根莖，乙醇體積濃度60%，液固比5∶1，420 W，結(jié)果見(jiàn)圖4.

由圖4可看出，提取初期總黃酮得率隨提取時(shí)間的增加而增大，且提取率增長(zhǎng)很快；但越接近提取終點(diǎn)，總黃酮成分?jǐn)U散越慢，雜質(zhì)溶出越多，得率隨時(shí)間的增大而增加較緩慢.這主要是由于總黃酮有一定的極性，非常容易被乙醇溶液提取.綜合以上考慮選擇提取時(shí)間以20 min為宜.

2.2.4 超聲波功率對(duì)超聲波提取效果的影響

分別考察不同超聲波功率對(duì)總黃酮得率的影響，超聲波條件：10.000 g左右的刺五加根莖，乙醇體積濃度60%，液固比5∶1，20 min,其結(jié)果見(jiàn)圖5.

圖4 提取時(shí)間對(duì)超聲波提取效果的影響

表1 因素水平表

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，一般來(lái)說(shuō)超聲功率越高越容易獲得較大的影響，提取率隨著超聲波功率增大而增加.但是，超聲強(qiáng)度對(duì)提取率的影響呈非線性關(guān)系,還需要考慮超聲波與介質(zhì)相互作用的程度和提取物的性質(zhì)等多方面的因素.本試驗(yàn)在設(shè)定頻率下，選用不同的功率進(jìn)行提取.由圖5可見(jiàn)，超聲波功率在此范圍內(nèi)時(shí)，總黃酮提取率在小功率變化范圍內(nèi)波動(dòng)不大，隨著功率提高提取得率上升，在本試驗(yàn)中最佳提取功率為500 W[6].

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析結(jié)果表

2.3 正交試驗(yàn)

選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，并以總黃酮的得率為考察指標(biāo)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1.

由表2可知，各因素對(duì)總黃酮得率指標(biāo)影響的逐次順序?yàn)锳>B>D>C，依據(jù)k1、k2、k3、k4確定最佳提取工藝組合為A1B1C2D2.由本正交試驗(yàn)結(jié)果R值的大小可以看出乙醇濃度對(duì)總黃酮得率的影響最大，液固比的影響次之，超聲波功率影響較小，提取時(shí)間的影響最小，由此得到提取刺五加中總黃酮的最佳提取工藝條件如下：乙醇的濃度為60%，液固比為5∶1，超聲波提取時(shí)間為20 min，超聲波功率為500 W，此條件下總黃酮得率達(dá)到22.462 mg/g以上.

2.4 超聲提取與其它提取方法的比較

對(duì)野生刺五加根莖采用不同方法提取，總黃酮的得率分別見(jiàn)表3.

表3 不同提取方法的總黃酮得率

由表3可見(jiàn)，乙醇浸提和超聲波輔助提取法效果較好，但后者大大縮短了提取所需時(shí)間，提取溶劑用量少，降低了能耗，所以采用超聲波輔助提取法提取效果更好.據(jù)資料表明微波輔助萃取法的效率也較好，但由于本試驗(yàn)微波萃取過(guò)程中的工藝條件選取不佳，使得提取不充分或總黃酮的結(jié)構(gòu)遭破壞，導(dǎo)致本試驗(yàn)所得提取率相對(duì)較低[7].

3 結(jié)束語(yǔ)

本文對(duì)野生刺五加活性成分之一總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，并比較了不同提取工藝的提取率，得出超聲波提取法的提取率最高.通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了各相關(guān)因素對(duì)提取率的影響，設(shè)計(jì)了超聲波法提取總黃酮的正交試驗(yàn)，確定出超聲波法提取刺五加中總黃酮的最佳工藝條件如下：以60%乙醇作為溶劑，液固比為5∶1，超聲提取時(shí)間20 min，超聲波功率為500 W，此時(shí)得率達(dá)到22.462 mg/g以上.采用分光光度法測(cè)定了刺五加中總黃酮的含量，結(jié)果表明：本法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好.該研究結(jié)果為刺五加的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù).

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