于澤源，劉雨娜，李興國，單金友

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150070；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所，黑龍江 綏棱 152204）

RAPD作為一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，自誕生以來就受到廣泛的重視和應(yīng)用，是進行遺傳圖譜構(gòu)建、物種親緣關(guān)系鑒定、輔助育種等方面研究的有效手段[1]，逐漸被人們應(yīng)用于植物遺傳和育種的各個領(lǐng)域[2－3]。通常利用RAPD技術(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜需要有親本單交產(chǎn)生的F2群體、回交群體（Backcross Population）、重組自交系（Recombinant Inbred Lines）、雙單倍體群體（Double Haploid）等，這對多年生果樹來說并不容易[4]，在傳統(tǒng)果樹雜交育種理論的基礎(chǔ)上，提出“雙假測交戰(zhàn)略”（Double Pseudo-testcross Strategy），利用多年生果樹遺傳上高度雜合的特點，雜交后代就相當(dāng)于F1自交，產(chǎn)生F2代群體，即以F1代為作圖群體，使多年生果樹遺傳作圖的難題迎刃而解。而利用F1群體構(gòu)建RAPD遺傳連鎖圖譜，必須首先了解RAPD在F1代的分離情況。本研究對大果沙棘品種間雜交F1代進行了RAPD分析，以期為開展沙棘分子遺傳育種及連鎖圖譜的構(gòu)建提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材取自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果研究所。供試材料為7個大果沙棘雜交組合及184株后代株系（見表1）。

表1 雜交組合及株系數(shù)Table 1 Number of plant and hybridization combinations

材料楚伊，果實圓柱形、橘黃色、果柄長度36 mm、百粒重65.17 g，枝條無刺或少刺；HS-20、HS-21、HS-22均為從蒙古沙棘烏蘭格木實生后代中選出的優(yōu)系，果實橢圓形～近圓形、橙紅色～橙色、果柄長度31～40 mm、百粒重48～88.25 g，枝條少刺或無刺；阿列伊為雄株授粉品種，生長勢強、抗逆性強、枝條無刺；蒙優(yōu)1、蒙優(yōu)2、蒙優(yōu)3、蒙優(yōu)4均為從蒙古沙棘烏蘭格木實生后代中選出優(yōu)良的授粉雄株，生長勢強、抗逆性強、枝條少刺或無刺。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

PE-9600型PCR擴增儀（美國Perlin Elmer公司）、BEACKMAN DU-7紫外分光光度儀（德國）、DYY-III型水平式電泳槽（北京）等。

試驗所用引物購自上海生物工程公司，Taq酶、dNTP、Buffer緩沖液、瓊脂糖購自廣州寶泰克公司，常規(guī)藥品購自哈爾濱伊事達公司。

1.2.2 基因組DNA的提取

用改良的CTAB法提取基因組DNA[5]。

1.2.3 RAPD擴增反應(yīng)

PCR擴增采用25 μL反應(yīng)體系，其中包括Taq酶 1 U，Mg2+2 μL，Buffer（10×）2.5 μL，dNTP 0.2 mmol·L-1，DNA 2 μL（約30 ng），引物5 pmol，不足的體積用超純水補足。

反應(yīng)程序如下：95℃7 min，94℃1 min，41℃1 min，72℃2 min，共40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。擴增產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中1.5%瓊脂糖凝膠、電壓100 V、電泳2 h，EB染色，凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1代的RAPD分析

從120個隨機引物中篩選出28個引物，這28個引物均擴增5條帶以上，多態(tài)性及其豐富，可用于大果沙棘雜交F1代的RAPD分析，共擴增出601條譜帶，其RAPD標(biāo)記分離情況見表2。

表2 7個大果沙棘雜交組合F1代的RAPD分離方式Table 2 RAPD segregation pattern of F1 of seven big fruit sea-buckthorn hybridization combinations

2.1.1 RAPD標(biāo)記符合孟德爾遺傳分離規(guī)律

RAPD標(biāo)記符合孟德爾遺傳分離規(guī)律的情況分為F1代不分離、按1∶1分離和按3∶1分離。

在F1代不分離的RAPD標(biāo)記既有雙親共有標(biāo)記，也有單親特有標(biāo)記。由表2可以看出，雙親共有標(biāo)記是不分離標(biāo)記的主體，同時亦是RAPD標(biāo)記分離的主要方式，也反應(yīng)了RAPD標(biāo)記為顯性遺傳標(biāo)記的特征。這類標(biāo)記在F1代個體中存在與缺失的理論比例應(yīng)為F1代單株數(shù)19∶0，如在雜交組合6中，雙親共有標(biāo)記S31-1 500存在與缺失的比例應(yīng)為19∶0，實際分離比例為18∶1（見圖1），在統(tǒng)計學(xué)上符合19∶0的分離比例。又如在雜交組合1中母本特有標(biāo)記S96-500存在與缺失的理論比例和實際比例分別為27∶0和24∶3（見圖2），在統(tǒng)計學(xué)上也是符合的。

F1代按1∶1分離的RAPD標(biāo)記包括母本特有標(biāo)記和父本特有標(biāo)記，如雜交組合2中母本特有標(biāo)記S112-1 000的實際分離比例為14∶16，雜交組合1中父本特有標(biāo)記S134-800的實際分離比例為14∶13，在統(tǒng)計學(xué)上符合1∶1的比例。

F1代按3∶1分離的RAPD標(biāo)記僅發(fā)生在雙親共有標(biāo)記上，如雜交組合6中S31-300的實際分離比例為14∶5（見圖1），在統(tǒng)計學(xué)上符合3∶1的比例。

圖1 引物S31對雜交組合6的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification result of primer S31 on hybridization combination 6

圖2 引物S96對雜交組合1的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification result of primer S96 on hybridization combination 1

2.1.2 RAPD標(biāo)記偏離孟德爾分離規(guī)律

F1個體中RAPD標(biāo)記存在與缺失的比例，在統(tǒng)計學(xué)上偏離1∶1或3∶1的孟德爾分離比例，如雜交組合7中，母本特有標(biāo)記S167-1 000（見圖3），雜交組合2中雙親共有標(biāo)記S84-800的實際分離比例分別為9∶13和12∶18，分別偏離了1∶1和3∶1的理論比例。

2.1.3 RAPD標(biāo)記異常分離

異常分離標(biāo)記是指非親RAPD標(biāo)記，即雙親均無但在F1代出現(xiàn)。本試驗共檢測出24條異常分離的RAPD標(biāo)記，各雜交組合的異常分離的標(biāo)記各不相同，其中雜交組合1和雜交組合6中的異常分離標(biāo)記最多，都為5條，其次是雜交組合2和雜交組合3，都檢測出4條，異常分離標(biāo)記最少的是雜交組合4，只檢測出1條異常分離的標(biāo)記。

2.2 不同分離類型的RAPD標(biāo)記的出現(xiàn)頻率

對各組雜交F1代分離情況進行分析可知，在F1代不發(fā)生分離的RAPD標(biāo)記中，雙親共有標(biāo)記不分離占多數(shù)，雙親特有標(biāo)記不分離只占少數(shù)；母本特有標(biāo)記不發(fā)生分離的比例要高出父本特有標(biāo)記的不分離比例。表明雙親共有標(biāo)記在F1代大多不發(fā)生分離，是不分離標(biāo)記的主體。同時表明，7個雜交組合中的母本基因組中純合基因位點所占比例均高于父本基因組中純合基因位點所占的比例。

圖3 引物S167對雜交組合7的擴增結(jié)果Fig.3 Amplification result of primer S167 on hybridization combination 7

在F1代符合1∶1或 3∶1孟德爾分離比例的RAPD標(biāo)記中，雙親共有標(biāo)記、母本特有標(biāo)記和父本特有標(biāo)記所占比例依次增加，表明單親特有標(biāo)記在F1代多發(fā)生符合孟德爾規(guī)律的分離，是正常分離標(biāo)記的主體。

3 討論與結(jié)論

本研究觀察到7個雜交組合F1代分別有29.5%、19.8%、32.3%、23.7%、34.4%、25.0%、23.6%RAPD標(biāo)記偏離孟德爾分離規(guī)律。如雜交組合1中，父本特有標(biāo)記S29-780，雜交組合7中，母本特有標(biāo)記S167-1 000等。從已有報道[6-7]和本研究來看，不規(guī)則分離的RAPD標(biāo)記往往集中在少數(shù)幾個連鎖群體，表明不同染色體在雜交過程中“活躍”程度不同，即發(fā)生結(jié)構(gòu)重排、缺失、插入和突變等的幾率存在變異。

本試驗中，7個雜交組合后代共擴增出24條異常分離的標(biāo)記，這些標(biāo)記在雙親的譜帶中均未發(fā)現(xiàn)，其中以引物S84擴增的異常分離標(biāo)記最多達3個，這些標(biāo)記大多集中在300～800 bp之間。Davis等在鷹嘴豆和二倍體草莓的作圖群體中發(fā)現(xiàn)了10個長度在300～1 350 bp的共顯性RAPD標(biāo)記，認(rèn)為這些帶是雙親所不具備的異源雙鏈體，其泳動速度低于兩個相應(yīng)的親本帶，在PCR擴增前將雙親DNA混合可以導(dǎo)致異源雙鏈體的出現(xiàn)[8]。這種由等位RAPD產(chǎn)物形成的非親RAPD可提供共顯性RAPD標(biāo)記，并且能提供新的RAPD多態(tài)性，在研究育種行為以及親緣關(guān)系等方面具有重要應(yīng)用價值。

[1]吳少華,張大生.RAPD技術(shù)在果樹上的應(yīng)用[J].亞熱帶植物科學(xué),2002,31(增):1-6.

[2]Welsh J,Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Research,1990,18(24):7213-7218.

[3]Williams J G K,Kubelik A R,Livak K J,et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Research,1990,18(22):6531-6535.

[4]Hemmat M,Weeden N F,Manganaris A G,et al.Molecular marker linkage map for apple[J].The Journal of Heredity,1994,85(l):4-11.

[5]顧紅雅.植物分子生物學(xué)實驗手冊[M].北京:高等教育出版社,1998:3-12.

[6]劉孟軍,Shin Y U,Yae B W.RAPD標(biāo)記在蘋果屬種間雜交一代的分離方式[J].園藝學(xué)報,1998,25(3):214-219.

[7]Hashizume T,Shimamoto I,Harushima Y,et al.Construction of a linkage map for watermelon using randomly am plified polymarphic DNA(RAPD)[J].Euphytica,1996,90(3):265-273.

[8]Davis T M,Yu H,Haigis K M,et al.Template mixing a method of enhancing detection and interpretation of codominant RAPD markers[J].Theor Appl Genet,1995,91(4):582-588.