袁 文，張 鈺，劉忠華，潘金春，王 靜，羅琴芳，黃 韌

（廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510260）

諾如病毒（norovirus）屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，無囊膜，二十面體對稱，核酸為單鏈正股RNA。諾如病毒可以感染人和動物，人諾如病毒是人類重要的病原體，90％以上的非細菌性胃腸炎疾病是由該病毒引起［1］。鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）是一種新發(fā)現(xiàn)的感染實驗小鼠的病毒，2002年Karst從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）以及重組體激活基因2（RAG2）缺陷（RAG2-/-/STAT1-/-）小鼠中，首次發(fā)現(xiàn)并分離到了小鼠諾沃克病毒-1（murine norovirus-1，MNV-1）。MNV-1可以導(dǎo)致RAG2-/-/STAT1-/-小鼠發(fā)生致死性感染，組織病變主要包括腦炎、腦膜炎、腦脈管炎、肝炎和肺炎［1］。

MNV是目前第一個報道能夠在細胞復(fù)制的諾如病毒，它可以在原代巨噬細胞和樹突狀細胞上生長，也可在傳代細胞小鼠巨噬細胞系RAW264.7上生長并產(chǎn)生細胞病變［2］。MNV在體外的可復(fù)制性為MNV的生物學(xué)特性、致病機理和診斷試劑等方面的研究提供了基礎(chǔ)，MNV也是人諾如病毒研究的理想病毒模型。MNV被認為是目前已知的小鼠病毒中最流行的一種病毒，調(diào)查發(fā)現(xiàn)在北美小鼠中感染率為22.1％（n=12639）［3］，在日本的感染率為13.1％（n=245）［4］。目前國內(nèi)尚無該病毒感染率的報道，為了解MNV在廣東省實驗小鼠中的自然感染情況，我們對省內(nèi)一些小鼠繁育設(shè)施進行了感染情況的調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 動物

被檢小鼠來自廣東省7個小鼠繁育設(shè)施［生產(chǎn)許可證號分別為：SCXK（粵）2008-0020、SCXK（粵）2008-0002、SCXK（粵）2008-0003、SCXK（粵）2008-0008、SCXK（粵）2004-0011、SCXK（粵）2006-0015和SCXK（軍）2007-014］共206只，隨機抽樣，抽樣時按照GB14922.2-2001標準進行，抽樣基數(shù)為生產(chǎn)群的數(shù)量。206只小鼠經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗（試劑盒購自中國藥品生物制品檢定所）檢測血清抗體，確認無淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）、鼠痘病毒（Ect）、仙臺病毒（SV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠肺炎病毒（PVM）、呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo-3）、小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠細小病毒（MVM）、多瘤病毒（POLY）、小鼠出血熱病毒（HV）10種病毒感染。

1.2 主要試劑

AMV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、DNA分子量marker、購自大連寶生物公司。病毒RNA提取試劑盒（Q IAamp Viral RNA Mini Kit）購自Qiagen公司。其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 樣品采集、處理及RNA提取

對所有動物實施安樂死后，無菌采集206只小鼠盲腸內(nèi)容物，無菌手術(shù)在廣東省實驗動物監(jiān)測所屏障動物實驗設(shè)施［SYXK（粵）2009-0019］進行，取適量滅菌的PBS加入裝有樣品的離心管中，漩渦混勻，12000r/min離心10min，取上清液通過0.22μm濾膜（Pall corporation）過濾，使用Q IAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取濾液中病毒的總RNA，提取方法依照說明書進行，RNA保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR

1.4.1 引物：引物參考有關(guān)文獻［5］，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物P1：5′-CAGATCACATGCTTCCCAC-3′；下游引物 P2：5′-AGACCACAAAAGACTCATCAC-3′，引物位于MNV序列保守區(qū)域衣殼基因編碼區(qū)位置，擴增產(chǎn)物大小為187bp，該引物可以擴增MNV-1、MNV-2、MNV-3和MNV-4四種類型毒株。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄：MNV為正股RNA病毒，因此用下游引物進行反轉(zhuǎn)錄。在一DEPC處理的0.2mL的Eppendorf管中依次加入以下試劑：5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，P2（10μmol/L）1μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μL，RNA酶抑制劑0.5μL，RNA模板10μL，加DEPC-H2O至20μL。反應(yīng)條件：42℃孵育1h，95℃5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，得到的反應(yīng)產(chǎn)物為cDNA。

1.4.3 PCR：取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 4μL作為PCR擴增的模板，再加入10×PCR buffer（含Mg2+）2μL，dNTPs（2.5mmol/L）1.6μL，P1（10μmol/L）1.5μL，P2（10μmol/L）1.5μL，Taq DNA聚合酶0.4μL，加ddH2O至20μL。引物的反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共進行40個循環(huán)，最后72℃延伸10min。每次反應(yīng)均設(shè)陰性對照。

1.5 PCR產(chǎn)物鑒定

取5μL PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，以DL2000marker作分子量參照，紫外燈下觀察，拍照。

1.6 PCR產(chǎn)物測序及序列比較分析

經(jīng)電泳鑒定為陽性的4個PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，并用NCBI網(wǎng)站Blast軟件對其進行核苷酸同源性分析，驗證產(chǎn)物的特異性。

2 結(jié)果

2.1 部分樣本RT-PCR電泳結(jié)果

RT-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳后，用紫外線燈觀察，陽性樣本在187bp位置有一條目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

1-12：樣本；M：DNA markerDL2000圖1 部分樣本RT-PCR電泳結(jié)果Lane 1-12：samples；LaneM：DNA markerDL2000Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR products from some of the samples

2.2 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

測序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物大小為187bp，4個產(chǎn)物序列一致。應(yīng)用NCBI網(wǎng)站Blast軟件對其進行序列比較分析，發(fā)現(xiàn)與GenBank中登錄的不同年份和不同國家MNV毒株的核苷酸同源性在95.2％以上（表1），證實引物所擴增的片斷為MNV基因。

2.3 廣東省MNV感染情況調(diào)查結(jié)果

206份樣本中有77份為陽性，陽性率為37.38％。各小鼠繁育設(shè)施抽樣情況及MNV感染情況見表2，從表中可以看出7個設(shè)施中有4個設(shè)施小鼠未發(fā)生MNV感染，另外3個設(shè)施小鼠感染率很高。卡方檢驗分析表明發(fā)生MNV感染的3個設(shè)施之間感染率差異無顯著性（P＞0.05），3個發(fā)生MNV感染的設(shè)施中各品系小鼠之間的感染率差異無顯著性（設(shè)施A：P＞0.05，設(shè)施B：P＞0.05，設(shè)施C：P＞0.05）。

表1 MNV PCR產(chǎn)物序列核苷酸同源性分析Tab.1 Nucleotide sequence analysis of MNV detected from the feces of mice

表2 不同小鼠繁育設(shè)施各品系小鼠的MNV感染情況Tab.2 TheMNV infection rate in variousmice strains at different breeding facilities

表3 小鼠繁育設(shè)施A、B、C中各品系小鼠的MNV感染總體情況Tab.3 The total MNV infection rate of various mice strains at breeding facility A，B and C

3個發(fā)生自然感染的設(shè)施中各品系小鼠的MNV總體感染情況見表3?？ǚ綑z驗表明各品系小鼠之間的感染率無顯著差異（P＞0.05）。近交系（19/22，86.36％）、封閉群（23/35，65.71％）和免疫缺陷小鼠（35/52，67.31％）之間感染率無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

自2003年Karst等［1］首次報道MNV以來，MNV被認為是目前小鼠中最流行的一種病毒。MNV感染的診斷主要通過血清學(xué)方法，Hsu建立了一種高通量的新型血清學(xué)檢測方法流式熒光微球檢測技術(shù)，檢測發(fā)現(xiàn)小鼠飼養(yǎng)設(shè)施中自然感染MNV非常普遍［3］。RT-PCR方法也是診斷MNV感染的有效方法［5］，該方法可以直接檢測多種樣本如糞便、器官和組織等，敏感性比血清方法高。國內(nèi)尚無小鼠感染該病毒的報道，也沒有相關(guān)的抗體檢測EL ISA試劑盒，因此我們采用敏感性更高的RT-PCR檢測方法。由于沒有陽性對照樣本，為了驗證產(chǎn)物的特異性，我們對部分陽性擴增產(chǎn)物進行測序分析，并與GenBank中登錄的MNV毒株進行了核苷酸同源性比較，結(jié)果證實擴增產(chǎn)物為MNV基因。

從檢測結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)受調(diào)查的7個繁育設(shè)施中有3個設(shè)施的小鼠MNV感染率非常高，而其他4個設(shè)施的感染率為零，統(tǒng)計分析表明發(fā)生MNV感染的3個設(shè)施之間感染率無顯著差異，各個設(shè)施中各品系小鼠之間的感染率也無顯著差異，各品系小鼠均對MNV易感。造成MNV感染的原因可能是3個設(shè)施所屬單位在動物飼養(yǎng)管理中存在漏洞，導(dǎo)致病毒由外界傳入。而MNV持續(xù)性感染的特性也加速該病毒的傳播，導(dǎo)致感染率上升。MNV主要經(jīng)糞-口途徑傳播、也可以經(jīng)呼吸道傳播［6］，研究發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)口接種MNV后通過糞便持續(xù)地向外排毒，至少在感染后8周仍可以從糞便和組織中檢測到病毒核酸，表現(xiàn)出很強的持續(xù)性感染［3，5］，因此很難通過檢測和淘汰（test-and-removal）方法從受污染的設(shè)施徹底根除MNV［7］。研究發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)口接種感染后第60天，在卵巢和子宮沒有檢測到病毒，因此剖腹產(chǎn)應(yīng)當是凈化MNV的有效方法［4］。此外，綜合3個發(fā)生感染的設(shè)施中各品系小鼠感染數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)各品系小鼠之間的感染率無顯著差異，所有近交系、封閉群和免疫缺陷小鼠均對MNV易感，感染率無顯著差異，說明MNV感染無品系特異性。

目前沒有證據(jù)表明MNV是否干擾小鼠實驗研究，但是MNV對幾種免疫缺陷小鼠有致病性。研究發(fā)現(xiàn)MNV-1可以導(dǎo)致一些固有免疫系統(tǒng)應(yīng)答組分缺陷的小鼠RAG2-/-/STAT1-/-、STAT1-/-、STAT1-/-/PKR-/-和IFNαβγR-/-發(fā)生致死性感染［1］。一些自然感染MNV的RAG1-/-/IFNγR-/-和RAG1-/-/STAT1-/-免疫缺陷小鼠臨床癥狀表現(xiàn)為體重下降、翹毛和弓背，病理分析發(fā)現(xiàn)小鼠有中度到重度的肝炎、中度間質(zhì)性肺炎和偶發(fā)的腹膜炎［8］。而野生型小鼠、其他一些免疫缺陷小鼠如RAG1-/-和RAG2-/-接種MNV后不發(fā)生死亡，也不表現(xiàn)出臨床癥狀［1］。在實驗過程中我們未發(fā)現(xiàn)抽檢的小鼠表現(xiàn)出異常的癥狀和眼觀病理變化。

鑒于MNV在小鼠中如此高的感染率以及對一些免疫缺陷小鼠產(chǎn)生致病性，我們應(yīng)當予以重視，加強動物的飼養(yǎng)管理。由于MNV是一種新發(fā)小鼠病毒，國內(nèi)對MNV的研究工作尚未深入展開，需加強國內(nèi)MNV感染狀況、致病性、檢測技術(shù)等方面的研究。

［1］Karst，S M，Wobus CE，LayM，et al.STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus［J］.Science，2003，299：1575-1578.

［2］Wobus，CE，Karst S M，Thackray LB，et al.Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages［J］.PLoSBiol，2004，2（12）：e432.

［3］Hsu，CC，Wobus CE，Steffen EK，et al.Development of a microsphere-based serologic multiplexed fluorescent immunoassay and a reverse transcriptase PCR assay to detect murine norovirus 1 infection in mice［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2005，12（10）：1145-1151.

［4］Goto K，Hayashimoto N，Yasuda M，et al.Molecular detection of murinenorovirus from experimentally and spontaneously infected mice［J］.Exp Anim，2009，58（2）：135-140.

［5］Hsu CC，Riley LK，W ills HM，et al.Persistent infection with and serologic cross-reactivity of three novel murine noroviruses［J］.Comp Med，2006，56（4）：247-251.

［6］Wobus CE，Thackray LB，Virgin HW IV.Murine norovirus：a model system to study norovirus biology and pathogenesis［J］.J Virol，2006，80（11）：5104-5112.

［7］Kastenmayer RJ，Perdue KA，ElkinsWR.Eradication of murine norovirus from a mouse barrier facility［J］.J Am Assoc Lab Anim Sci，47：26-30.

［8］Ward JM，Wobus CE，Thackray LB，et al.Pathology of immunodeficient mice with naturally occurring murine norovirus infection［J］.Toxicol Pathol，2006，34（6）：708-715.