張惠靜，畢穎楠，郝敦玲

（第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系分析化學(xué)教研室，重慶 400038）

1 引 言

腫瘤治療中是否發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是指導(dǎo)臨床制訂治療方案、判斷預(yù)后面臨的主要問題。隨著對(duì)腫瘤微轉(zhuǎn)移的深入研究，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）已成為當(dāng)前腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，用來揭示腫瘤轉(zhuǎn)移行為、反映腫瘤的侵襲性，從而指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療并對(duì)患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估[1-2]。因此，CTCs的檢測(cè)在臨床診斷、抗癌治療以及開發(fā)新型的抗癌藥物中占有突出的地位。目前循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs已被用來研究多種腫瘤（如結(jié)腸癌[3]、乳腺癌[4]、前列腺癌[5]、直腸結(jié)腸癌[6]等）的微轉(zhuǎn)移并指導(dǎo)臨床治療。

2 CTCs檢測(cè)方法

血道轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移重要的方式之一，絕大多數(shù)的腫瘤都通過其脫落細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)進(jìn)而侵襲其他臟器進(jìn)行遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。因此，在外周血中檢測(cè)到CTCs是預(yù)示腫瘤早期轉(zhuǎn)移（特別是尚未發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移病灶時(shí)）最直接的方法，在腫瘤早期轉(zhuǎn)移的臨床診斷中具有積極的意義。但是，對(duì)于數(shù)以億萬計(jì)的外周血細(xì)胞而言，CTCs在外周血中的數(shù)量稀少，大約每105～107個(gè)單核細(xì)胞中才有一個(gè)CTCs[7]。因此，發(fā)展穩(wěn)定、靈敏以及特異性高的檢測(cè)方法是解決CTCs檢測(cè)問題的關(guān)鍵[8]?，F(xiàn)有針對(duì)CTCs的檢測(cè)技術(shù)主要包括細(xì)胞富集技術(shù)和鑒定技術(shù)兩類。

2.1 細(xì)胞篩選/富集技術(shù)

由于外周血中CTCs所占的比率極低（常低于1/106），因此首先要對(duì)血液樣本中的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行富集以提高其檢出率，增加檢測(cè)的敏感性。常用的細(xì)胞富集技術(shù)主要有免疫磁分選、密度梯度離心和細(xì)胞過濾等。

免疫磁分選技術(shù)（Immunomagnetic Separation，IMS）是基于特異性免疫識(shí)別原理的細(xì)胞篩選富集技術(shù)。它將針對(duì)腫瘤細(xì)胞膜蛋白的特異性抗體（如EpCAM、Ber EP4、Cytokeratins等）包被于磁珠表面以完成腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別，借助外加磁場(chǎng)完成對(duì)CTCs的篩選/富集。這類技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于分選過程避免了細(xì)胞裂解，從而降低后續(xù)鑒定工作中的干擾因素，并可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。篩選富集模式有陽(yáng)性分選和陰性分選，也可將兩種模式結(jié)合，進(jìn)一步降低血細(xì)胞含量，提高富集效率。Hu等[9]成功利用免疫磁分選技術(shù)對(duì)臨床樣本中的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行篩選/富集，研究顯示，IMS能夠有效地富集腫瘤細(xì)胞，從而提高樣本中CTCs檢出的陽(yáng)性率。目前，市場(chǎng)上商品化的CTCs專用檢測(cè)儀僅有美國(guó)Veridex公司生產(chǎn)的CellSearch系統(tǒng)，該儀器已通過FDA認(rèn)證，是一項(xiàng)集合了免疫磁分選技術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)法的分離檢測(cè)技術(shù)，通過在磁珠上固定anti-EpCam抗體特異性的識(shí)別、結(jié)合靶細(xì)胞，在外加磁場(chǎng)的作用下完成腫瘤細(xì)胞的篩選/富集，經(jīng)熒光染料染色后，借助熒光成像技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，從而完成對(duì)CTCs的檢測(cè)。由于ISM需借助細(xì)胞表面特異性標(biāo)記作為篩選的靶標(biāo)，因此靶標(biāo)的表達(dá)狀況便會(huì)影響分析方法的敏感性和特異性。例如，炎癥性疾病、生理變化、樣本中非腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)等因素會(huì)造成假陽(yáng)性的結(jié)果，而分離過程中CTCs的丟失、循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞的高度異質(zhì)性等因素則會(huì)造成假陰性的結(jié)果。

密度梯度離心法和細(xì)胞過濾技術(shù)均是運(yùn)用物理方法富集篩選有核細(xì)胞。商品化的OncoQuick離心分離管根據(jù)細(xì)胞的密度及大小的差異，通過梯度離心將低密度細(xì)胞（包括表皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板）富集在一起；ISET（Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells）分離技術(shù)則依據(jù)細(xì)胞的尺寸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過濾，從而篩選/富集腫瘤細(xì)胞。由于這兩種富集方法是借助細(xì)胞的物理特性，因此篩選不具特異性，所富集的細(xì)胞中不僅含有腫瘤細(xì)胞，還存在不同種類的其他細(xì)胞（特別是單核細(xì)胞）。因此，在后續(xù)工作中進(jìn)行細(xì)胞鑒定時(shí)，由于腫瘤細(xì)胞的差異表達(dá)和基因標(biāo)志物的非特異性，血液中單核細(xì)胞帶來的干擾會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果呈假陽(yáng)性。

2.2 腫瘤細(xì)胞鑒定技術(shù)

對(duì)外周血樣本進(jìn)行富集處理之后并不能完成CTCs的檢測(cè)，必須聯(lián)合應(yīng)用其他細(xì)胞鑒定技術(shù)來確定細(xì)胞的種類和來源。因此，選用特異性的檢測(cè)技術(shù)或方法對(duì)CTCs及其分子進(jìn)行確認(rèn)是完成整個(gè)鑒定過程的關(guān)鍵步驟。常用的鑒定檢測(cè)技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（Immunocytochemistry，ICC）、熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）和流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）等。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）以腫瘤和上皮組織中某種物質(zhì)的mRNA為標(biāo)志物檢測(cè)CTCs。由于mRNA標(biāo)志物不表達(dá)正常的外周血細(xì)胞，故在外周血中檢測(cè)到mRNA可以間接提示CTCs的存在。從Kopreski等[10]首次采用RT-PCR檢測(cè)黑色素瘤患者血漿中酪氨酸酶的mRNA以來，這一方法已廣泛用于多種實(shí)體瘤的CTCs檢測(cè)和研究[11-12]。RT-PCR及其各種改進(jìn)技術(shù)是目前檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞最有效的方法，但由于測(cè)定過程需破壞CTCs，因此無法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。此外，RT-PCR是對(duì)某個(gè)腫瘤標(biāo)志物的mRNA進(jìn)行檢測(cè)，因此取樣時(shí)上皮細(xì)胞污染、假基因干擾、腫瘤標(biāo)志物在非腫瘤細(xì)胞內(nèi)的非法轉(zhuǎn)錄等因素都可造成假陽(yáng)性結(jié)果。例如，CK19可表達(dá)于正常人和惡性血液病的病人中，其陽(yáng)性率分別為3.7%和14.3%。此外，炎癥、侵入性的檢查或者外科手術(shù)均可導(dǎo)致外周血樣品的污染，使分析結(jié)果呈現(xiàn)假陽(yáng)性。同時(shí)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和個(gè)體間腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)差異也可能造成假陰性結(jié)果。為解決這一問題，研究人員采用多標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)或RT-PCR技術(shù)與其他檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用（如Southern印跡、ELISA、MACS等）的方式提高方法的靈敏度與特異性，取得了良好的效果。

免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（ICC）和熒光原位雜交技術(shù)（FISH）均是在細(xì)胞富集的基礎(chǔ)上針對(duì)腫瘤特異的蛋白或基因進(jìn)行原位檢測(cè)，從而對(duì)篩選后的細(xì)胞完成鑒定。由于腫瘤細(xì)胞蛋白/基因表達(dá)的不穩(wěn)定性以及其他正常細(xì)胞存在非法表達(dá)，因此檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于所檢測(cè)目標(biāo)的表達(dá)狀況。例如，Kahn等用梯度離心法（Ficoll/Hypaque）首先對(duì)樣品中的細(xì)胞進(jìn)行富集，之后借助抗CK8抗體（CAM 5.2）對(duì)富集細(xì)胞進(jìn)行免疫化學(xué)染色，結(jié)果顯示此方法可以在每5mL外周血中檢測(cè)到5個(gè)腫瘤細(xì)胞。FISH技術(shù)以基因分子探針作為示蹤物雖然提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，但由于基因的差異性表達(dá)，分子探針并不能標(biāo)記所有的靶細(xì)胞，因此限制了此技術(shù)在外周血樣本中檢測(cè)稀缺CTCs的應(yīng)用。

流式細(xì)胞計(jì)數(shù)（FCM）是一項(xiàng)集激光、電子物理、光電測(cè)量、計(jì)算機(jī)、細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體技術(shù)為一體的細(xì)胞分選和分析技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)具有分析速度快、精度高、準(zhǔn)確度好等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)外周血樣本中的CTCs進(jìn)行定量計(jì)數(shù)，還可對(duì)細(xì)胞的物理、化學(xué)特性做多參數(shù)測(cè)量。然而，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶細(xì)胞的敏感度僅為1/104，而外周血中CTCs的數(shù)量常小于1/106，因此單純依靠FCM測(cè)定CTCs的方法敏感性仍存在爭(zhēng)議。通過與其他細(xì)胞富集技術(shù)（如磁珠富集）聯(lián)用可對(duì)CTCs進(jìn)行特異性富集，提高方法的敏感性和鑒別力，使CTCs的陽(yáng)性檢出率提高。

由于各種檢測(cè)技術(shù)的局限性和外周血樣品的特殊性，使得單純地依賴特異性的蛋白標(biāo)志物或基因標(biāo)志物的分析并不能完成對(duì)CTCs的準(zhǔn)確分析，必須聯(lián)合必要的細(xì)胞篩選/富集手段提高CTCs的濃度，從而提高分析的準(zhǔn)確性和靈敏度。然而，目前的檢測(cè)技術(shù)中，細(xì)胞篩選/富集過程和鑒定分析過程相互脫節(jié)，即需完成CTCs富集才能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞鑒定的過程。這種多步驟、分步式的檢測(cè)方式受人工操作、樣品轉(zhuǎn)移的影響極大，降低了檢測(cè)方法的靈敏性和可靠性。因此，建立一種集分選、富集和檢測(cè)于一體的分析技術(shù)是提高外周血中CTCs檢出率的重要途徑。

2.3 微流控分析芯片技術(shù)

近年來，隨著微流控和微機(jī)械加工技術(shù)（MEMS）的不斷完善和發(fā)展，微流控芯片技術(shù)在細(xì)胞水平上的生物學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷等領(lǐng)域里的優(yōu)勢(shì)日趨顯著[13-14]。微流控芯片又稱芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-Chip），該技術(shù)是將生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等基本操作單元集成或基本集成在一塊幾平方厘米的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)。該技術(shù)的基本特征和最大優(yōu)勢(shì)是多種單元技術(shù)在微小平臺(tái)上的靈活組合和大規(guī)模集成，可以將現(xiàn)行所有的細(xì)胞分析步驟和過程（如細(xì)胞操縱、細(xì)胞捕捉/篩選、細(xì)胞培養(yǎng)以及在線實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)分析等）整合于一塊微芯片上，實(shí)現(xiàn)分析操作的一體化。因此，基于微流控分析芯片技術(shù)在細(xì)胞分析和研究中所顯現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)，其在CTCs上的應(yīng)用研究也在積極展開并取得一定進(jìn)展。Nagrath等[15]在其研究中利用微流控親和色譜芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)全血樣本中CTCs的分離/富集。該研究在一塊2.5cm×6.6cm的芯片上，于1.9cm×5.1cm長(zhǎng)方形微腔中設(shè)置了70 000多個(gè)呈等腰三角形排列的微柱結(jié)構(gòu)，其柱高100μm，直徑100μm，柱間距50μm，并通過共價(jià)結(jié)合的方式將抗表皮細(xì)胞粘附分子（Anti-EpCAM）抗體固定于微腔中，構(gòu)成分離/富集區(qū)。通過優(yōu)化流速等條件借助抗原/抗體的親和作用，實(shí)現(xiàn)了毫升級(jí)外周血中多種腫瘤CTCs的篩選純化。研究表明，通過在芯片腔體中設(shè)置呈等腰三角形排列的微柱，不但能夠增大微結(jié)構(gòu)與細(xì)胞接觸的比表面積，而且這種構(gòu)型的微柱結(jié)構(gòu)還有效地避免了剪切力對(duì)細(xì)胞識(shí)別/捕獲的影響。隨后該研究小組又利用該系統(tǒng)從非小細(xì)胞肺癌患者的外周血中分離/富集CTCs，并利用離線的PCR技術(shù)完成了其表皮生長(zhǎng)因子受體基因（EGFR）的突變分析[16]。但該研究所用芯片以硅作為基片，芯片結(jié)構(gòu)復(fù)雜、造價(jià)昂貴，其細(xì)胞富集的平均純度只有50%左右。Adams等[17]構(gòu)建了一個(gè)具有51個(gè)波浪形微通道陣列的芯片，通道尺寸為長(zhǎng) 3.5 cm×寬 35 μm×深 150 μm，將Anti-EpCAM抗體固定于微通道表面，在37min內(nèi)成功地從全血中分離/富集出人乳腺癌細(xì)胞MCF－7，并通過整合的電導(dǎo)傳感器，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量計(jì)數(shù)分析，其捕獲率高達(dá)97%，純度近100%。該方法通過陣列化的捕獲通道設(shè)置，較好地解決了通量問題，但其檢測(cè)結(jié)果采用的是非選擇性的電導(dǎo)檢測(cè)技術(shù)。

目前，利用微流控芯片技術(shù)進(jìn)行CTCs檢測(cè)還在起步階段，在芯片設(shè)計(jì)、材料選用、檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用等方面仍存在不足，但此技術(shù)的出現(xiàn)卻為CTCs檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展提供了新的方法和思路。

3 發(fā)展與展望

綜上所述，CTCs的分析是一個(gè)多步驟聯(lián)合的分析過程，細(xì)胞篩選/富集技術(shù)與腫瘤細(xì)胞鑒定技術(shù)的聯(lián)用有助于提高外周血樣本中CTCs的檢出率，從而更為準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床治療。微流控芯片作為新出現(xiàn)的分析平臺(tái)以其靈活的設(shè)計(jì)、積木式的功能組裝為特點(diǎn)，將細(xì)胞篩選/富集功能區(qū)與細(xì)胞鑒定技術(shù)結(jié)合，在一張芯片上完成CTCs的檢測(cè)。這種技術(shù)有效地避免了分步操作造成的影響，從而提高了CTCs的檢出率。另外，由于芯片系統(tǒng)的設(shè)計(jì)靈活，在芯片內(nèi)可設(shè)置相應(yīng)的藥物篩選單元，為臨床個(gè)體化治療方案提供可能。雖然目前利用此技術(shù)完成對(duì)CTCs的檢測(cè)尚不成熟，但不可否認(rèn)微流控芯片的出現(xiàn)為CTCs的檢測(cè)和實(shí)現(xiàn)臨床的個(gè)體化治療提供了新的技術(shù)平臺(tái)。因此，利用微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行CTCs檢測(cè)將成為未來CTCs檢測(cè)研究的重點(diǎn)。如何建立一個(gè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，能夠針對(duì)多種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選以及將多步驟檢測(cè)過程實(shí)現(xiàn)在線整合的系統(tǒng)是今后微流控芯片系統(tǒng)檢測(cè)CTCs亟待解決的問題。

[1] Paterlini-Brechot P，Benali N L.Circulating tumor cells（CTC）detection：clinical impact and future directions[J].Cancer Lett.，2007，253（2）：180-204.

[2] 周小昀，李龍蕓.檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC在臨床腫瘤診斷和治療中的作用[J].癌癥進(jìn)展雜志，2006，4（3）：240-243.

[3] Giribaldi G，Procida S，Ulliers D，et al.Specific detection of cytokeratin 20-positive cells in blood of colorectal and breast cancer patients by a high sensitivity realtime reverse transcriptase-polymerase chain reaction method[J].J.Mol.Diagn.，2006，8（1）：105-112.

[4] Pinzani P，Salvadori B，Simi L，et al.Isolation by size of epithelial tumor cells in peripheral blood of patients with breastcancer：correlation with real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction results and feasibility of molecular analysis by laser microdissection[J].Hum.Pathol.，2006，37（6）：711-718.

[5] Mejean A，Vona G，Nalpas B，et al.Detection of circulating prostate derived cells inpatients with prostate adenocarcinoma is an independentrisk factor for tumor recurrence[J].J.Urol.，2000（163）：2022-2029.

[6] Costanzo F Di，Pinzani P，Orlando C，et al.Circulating tumour cells in colorectal cancer[J].European Journal of Cancer Supplements，2008，6（14）：52-59.

[7] Sleijfer S，Gratama J W，Sieuwerts A M，et al.Circulating tumour cell detection on its way to routine diagnostic implementation[J].Eur.J.Cancer，2007，43（18）：2645-2650.

[8]Smerage J B，Hayes D F.The measurementand therapeutic implications of circulating tumour cells in breast cancer[J].Br.J.Cancer，2006（94）：8-12.

[9] Hu X C，Wang Y，Shi D R，et al.Immunomagnetic tumor cell enrichment is promising in detecting circulating breast cancer cells[J].Oncology，2003，64（2）：160-165.

[10]Kopreski M S，Benko F A，Kwak L W，et al.Detection of tumor messenger RNA in the serum of patients with malignant melanoma[J].Clin.Cancer Res.，1999，5（8）：1961-1965.

[11]Helo P，Cronin A M，Danila D C，et al.Circulating prostate tumor cells detected by reverse transcription-PCR in men with localized orcastration-refractory prostate cancer：concordance with cellSearch assay and association with bone metastases and with survival[J].Clin.Chem.，2009，55（4）：765-773.

[12]Xi L Q，Nicastri D G，El-Hefnawy T，et al.Optimal markers for real-time quantitative reverse transcription PCR detection of circulating tumor cells from melanoma，breast， colon，esophageal，head and neck，and lung cancers[J].Clin.Chem.，2007，53（7）：1206-1215.

[13]El A J，Sorger P K，Jensen K F.Cells on chips[J].Nature，2006，442（7101）：403-411.

[14]Yager P，Edwards T， Fu E， et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health[J].Nature，2006，442（7101）：412-418.

[15]Nagrath S，Sequist L V，Maheswaran S，et al.Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology[J].Nature，2007，450（7173）：1168-1169.

[16]Maheswaran S，Sequist L V，Nagrath S，et al.Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells[J].N.Engl.J.Med.，2008，359（4）：366-377.

[17]Adams A A，Okagbare P I，F(xiàn)eng J，et al.Highly efficientcirculating tumor cellisolation from whole blood and label-free enumeration using polymer-based microfluidics with an integrated conductivity sensor[J].J.Am.Chem.Soc.，2008，130（27）：8633-8841.