張恩科，張瑤嬋，馬纏過

1．陜西省人民醫(yī)院 a.設備管理科；b.放療中心，陜西 西安 710068；2.陜西省西安市中心血站，陜西 西安 710061

電磁波生物效應對腫瘤化療增敏效果的研究

張恩科1a，張瑤嬋2，馬纏過1b

1．陜西省人民醫(yī)院 a.設備管理科；b.放療中心，陜西 西安 710068；2.陜西省西安市中心血站，陜西 西安 710061

化療是臨床癌癥治療最主要的手段之一。但化療所存在的藥物缺乏特異的敏感選擇性和嚴重的副作用等制約其在臨床實踐中的推廣和應用。本文探討擬采用生物學與電子工程學的實驗技術，在電磁波的生物效應對腫瘤細胞抑制的基礎上，研究電磁波的生物效應對化療的增敏作用，探索提高腫瘤化療治療效果的新途徑。

生物效應；化療；增敏；電磁波

本文導讀 ＞＞

課題背景：此課題為陜西省2008年自然科學研究資助項目（SJ08-2T10），本項目擬采用生物學與電子工程學的實驗技術，研究電磁波的生物效應對腫瘤化療增敏的效果與其作用的機理，探索提高腫瘤化療治療效果的新途徑。

實驗室/團隊:陜西省人民醫(yī)院設備科（醫(yī)學工程科）和臨床醫(yī)技科室各種醫(yī)療儀器和實驗測試設備齊全，建有陜西省人民醫(yī)院設備中心實驗室，有包括眾多進口測試設備在內的良好實驗設備和條件，能在優(yōu)越的條件支持下開展研發(fā)工作，特別是具有能密切聯(lián)系臨床實踐的便利。

合作單位西安交通大學生命科學學院建成有生物醫(yī)學工程研究所和省級重點專業(yè)實驗室，與我們有長期良好的合作關系，為實現(xiàn)電子信息與臨床醫(yī)學的跨學科研究提供了很好的協(xié)作條件，為本項目的支持和協(xié)作提供了另一個良好實驗研究基地。

實驗設計/論文構思：癌癥的發(fā)生和發(fā)展取決于細胞的增殖與凋亡是否平衡，而細胞的凋亡受胞內第二信使Ca2+的調控。胞內Ca2+濃度增加是不同化療藥物誘導癌細胞凋亡的共同通路。細胞中的Ca2+在癌癥的發(fā)生、細胞的凋亡、化療對癌細胞的殺傷等幾個方面都起著重要作用；而在特定參數(shù)的電磁波干預下，正常細胞和癌細胞中Ca2+濃度可以產(chǎn)生不同的變化。能否使用特定參數(shù)的電磁波與化療藥物協(xié)同作用，其中電磁波參數(shù)的選擇使癌細胞可產(chǎn)生窗效應，使電磁波與化療藥物分別誘導胞內Ca2+濃度升高疊加，并共同介導癌細胞凋亡，正常細胞則不會出現(xiàn)這樣的疊加，從而相對降低化療藥物對正常細胞的毒副作用。Ca2+通道阻滯劑通過對細胞中Ca2+濃度的影響，來逆轉癌細胞的多藥耐藥性，但它會引起許多副作用而不能實用于臨床。

應用要點：本項目擬研究電磁波的生物效應對腫瘤化療增敏的效果與其作用的機理，旨在提高腫瘤化療治療效果的新途徑，屬探索性基礎研究。

隨著人類生活環(huán)境、生活水平和生活方式的變化以及醫(yī)學的進步，疾病譜發(fā)生了顯著的變化，一般性傳染病逐漸被控制，而惡性腫瘤則日益成為常見且嚴重的威脅人類生命和生活質量的主要疾病之一?；熓桥R床癌癥治療最主要的成熟的治療手段之一。但化療所存在的藥物缺乏特異的敏感選擇性及同時存在的嚴重副作用等制約其在臨床實踐中的推廣和應用。如何提高放療藥物的敏感性是國內外科研、制藥和醫(yī)學界專家十分關注的前沿問題[1-8]。

1 研究背景

包括人類在內的多細胞機體均存在細胞不斷增殖與死亡。細胞死亡包括壞死 (necrosis)和凋亡 (apoptosis) 兩種方式。細胞凋亡是細胞主動的自殺過程，是由基因所控制的細胞自主有序死亡，凋亡體可從上皮細胞表面脫落或被周圍細胞吞噬清除，不伴隨壞死所特有的炎癥反應。凋亡對維持機體的正常發(fā)育及內環(huán)境的穩(wěn)定起著十分重要的作用。

在細胞凋亡的誘導中，作為肌醇磷脂代謝途徑中細胞信息轉導的第二信使，細胞內鈣離子（Ca2+）起著十分重要的作用。胞內Ca2+濃度的改變是細胞生理活動的重要物質基礎，并在細胞信號轉導、誘發(fā)一系列細胞功能事件中起重要作用。因此，細胞內Ca2+濃度平衡處于嚴格的調節(jié)控制之中。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內Ca2+濃度的高低調控著多種類型細胞的凋亡，具體表現(xiàn)為Ca2+內流和聚積可誘導多種細胞凋亡，被認為是細胞凋亡的共同途徑。而用鈣通道拮抗劑等方法阻止Ca2+內流則可減輕細胞損傷，抑制細胞凋亡。

化療藥物對癌癥治療有效的主要機制之一是誘導癌細胞凋亡。參與調控細胞凋亡的因素很多，包括細胞外信號、細胞內第二信使及細胞內各種酶類。Ca2+作為參與許多生命活動的第二信使，其在調控細胞凋亡中的作用尤其受到關注。大量實驗發(fā)現(xiàn)，化療中細胞凋亡主要由細胞內Ca2+介導，化療藥物在誘導對癌細胞的殺傷時均與癌細胞中的Ca2+濃度的增加密切相關。

但目前的化療方法還存在重要不足?；熕幬锶狈μ禺惖拿舾羞x擇性，在殺死癌細胞的同時，也同樣會殺傷正常細胞，并由此產(chǎn)生較為嚴重的副作用，如骨髓抑制、腎毒性導致腎衰、肌體免疫功能抑制、肝功能損傷、胃腸道反應、脫發(fā)、口腔潰瘍等。另外，毒副反應還會使化療藥物的劑量和療程受到限制，導致化療失敗。

另外，癌細胞對化學治療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性是癌癥治療不能取得治愈性療效的重要原因之一。多藥耐藥性是指癌細胞在接觸一種抗癌藥物后產(chǎn)生了耐受包括本藥物在內的多種結構迥然不同、作用機理也大相徑庭的抗癌藥物的抗藥性。國內外學者在器官、細胞和分子水平上對如何克服癌細胞耐藥性的問題，進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)了一些具有逆轉癌細胞多藥耐藥性的藥物，稱為化療增敏劑，其中引人矚目的是Ca2+通道阻滯劑。Ca2+通道阻滯劑的作用機制是能選擇性地阻斷Ca2+經(jīng)細胞膜上的Ca2+通道進入細胞內，從而降低細胞內的Ca2+濃度。但Ca2+通道阻滯劑作為一種具有心血管藥理作用的藥物，除了可能引起患者的傳導阻滯、低血壓、充血性心力衰竭等心血管系統(tǒng)的嚴重毒性反映外，還可能對患者的免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。

2 研究思路[9,10]

從前面的介紹中可以看出，癌癥的發(fā)生和發(fā)展取決于細胞的增殖與凋亡是否平衡，而細胞的凋亡受胞內第二信使Ca2+的調控?；熓悄壳爸委煱┌Y的主要方法之一，胞內Ca2+濃度增加是不同化療藥物誘導癌細胞凋亡的共同通路。但化療還存在重要缺陷：化療藥物在誘導癌細胞凋亡的同時，也會對正常細胞產(chǎn)生同樣的殺傷；化療中癌細胞會產(chǎn)生多藥抗藥性，從而導致化療失效，適合臨床使用的化療增敏方法目前尚未找到。

細胞中的Ca2+在癌癥的發(fā)生、細胞的凋亡、化療對癌細胞的殺傷等幾個方面都起著重要作用；而在特定參數(shù)的電磁波干預下，正常細胞和癌細胞中Ca2+濃度可以產(chǎn)生不同的變化。所有這些都為下列問題的提出打下了基礎：能否使用特定參數(shù)的電磁波與化療藥物協(xié)同作用，其中電磁波參數(shù)的選擇使癌細胞可產(chǎn)生窗效應，而正常細胞不會有窗效應時，使電磁波與化療藥物分別誘導胞內Ca2+濃度升高疊加，并共同介導癌細胞凋亡，正常細胞則不會出現(xiàn)這樣的疊加，從而相對降低化療藥物對正常細胞的毒副作用。Ca2+通道阻滯劑通過對細胞中Ca2+濃度的影響，來逆轉癌細胞的多藥耐藥性，但它會引起許多副作用而不能實用于臨床。注意到電磁波的非熱生物窗效應也可影響細胞中Ca2+的濃度，那么電磁波能否用于逆轉化療藥物的多藥耐藥性？需要哪些條件？

3 研究基礎

(1)實驗結果發(fā)現(xiàn)癌細胞內Ca2+出現(xiàn)窗效應對電磁波參數(shù)的要求相對正常細胞有其特點，既有相同的一面，又有不同的情況。結合這些特點設法增強化療藥物對癌細胞敏感性殺傷能力的研究已經(jīng)起步。初步的離體細胞層次的實驗表明，一定參數(shù)的電磁波可以提高化療藥物對癌細胞的選擇性殺傷能力，對正常細胞的殺傷相對可以減輕；

(2)初步建立和改進了不同癌細胞株及其正常對照細胞株、多藥耐藥性癌細胞株在電磁場干預下化療藥物誘導凋亡的體外細胞研究模型。其中利用改進的多藥抗藥性離體細胞實驗模型相比傳統(tǒng)模型具有抗藥性程度高，性能更穩(wěn)定的優(yōu)勢。

以上理論分析和研究表明，無論從科學研究還是臨床醫(yī)學的要求來說，都需要開展對電磁波非熱生物效應的進一步研究，探討電磁波對正常組織細胞和不同種類癌細胞的作用規(guī)律和作用機理，并將其應用于改進癌癥的治療，以造?；颊吆蜕鐣?。

4 研究方法[11,12]

(1)寬頻專用橫電磁波傳播小室即TEM小室 (Transverse Electromagnetic Cell，橫電磁波傳輸小室) 的研制，可產(chǎn)生不同參數(shù)、不同類型的電磁波，這些參數(shù)均可實時準確測量；

(2)建立和改進不同癌細胞及其正常對照細胞、多藥耐藥性癌細胞在電磁場干預下化療藥物誘導凋亡的體外研究模型；

(3)對不同類型癌細胞和正常對照組細胞進行電磁波作用下的非熱效應發(fā)生條件研究。改變電磁波的類型和參數(shù)，反復進行實驗，記錄各組實驗的照片和數(shù)據(jù)；分析提取可使癌細胞和正常對照組細胞發(fā)生非熱生物窗效應對電磁波參數(shù)的不同要求；

(4)從細胞和分子層次的生物學實驗研究、生物系統(tǒng)建模和細胞病理生理等角度對實驗結果進行分析解釋，探討癌細胞電磁波非熱生物效應的發(fā)生機理；

(5)在可使癌細胞發(fā)生窗效應，而正常細胞不發(fā)生生物窗效應的電磁波協(xié)同化療藥物作用下，應用驗證細胞凋亡的幾種不同方法檢查細胞凋亡情況，分別研究化療藥物誘導癌細胞和正常細胞凋亡的情況，分析提出電磁波對化療增敏方法與效果；

(6)在上述工作的基礎上，逐步研究可供動物實驗和臨床應用的電磁波協(xié)同癌癥化療增敏技術。

5 初步成果

本課題研究小組對電磁波干預不同生物組織的非熱生物學效應進行研究，完成20多例次實驗，取得了一些規(guī)律性的有價值的結果。

(1) 不同強度的電磁波對癌細胞增生有明顯抑制作用。選擇不同強度的電磁波(5mT、8mT、11mT)對人舌鱗癌細胞進行連續(xù)3天的輻照刺激，每天1h，通過MTT法和流式細胞術檢測細胞的增生、凋亡和細胞周期的變化；對照組采用相同的實驗條件和作用時間但不加磁場輻照。結果：MTT法檢測實驗組與對照組輻照后24h、48h、72h的OD(optical delnsity，光密度)值，通過SPSS軟件分析顯示實驗組比對照組的OD值顯著降低(P＜0.01)。流式細胞術檢測電磁場組與對照組細胞凋亡率無差異，但細胞周期有顯著改變(0.5mT)。

由此得出結論：不同強度的電磁場輻照對人舌鱗癌細胞增生有明顯抑制作用，并可阻滯細胞周期，但對舌鱗癌細胞的凋亡未發(fā)現(xiàn)明顯影響。

(2)電磁波作用于不同癌細胞及其正常對照細胞時胞漿Ca2+濃度窗效應的實驗研究?；静襟E是：制備各種細胞樣品，包括三種癌細胞及其對照正常細胞；對不同細胞樣品進行熒光負載，后用D-Hank’s液洗滌。先將每一樣品在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行熒光強度檢測，首先獲得沒有電磁波作用時的基礎數(shù)據(jù)；將這些樣品放在電磁波照射系統(tǒng)中接受電磁波輻照，并再次將每一樣品在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行熒光強度檢測，以獲得照射后數(shù)據(jù)；改變電磁波的類型和參數(shù)，反復實驗，記錄各組實驗的結果；然后，對數(shù)據(jù)進行分析，包括有電磁波作用和無電磁波作用時的數(shù)據(jù)分析、不同參數(shù)電磁波對同一樣品作用時的數(shù)據(jù)分析、不同種類癌細胞對不同參數(shù)電磁波作用時的窗效應表現(xiàn)等；最后，通過對各參數(shù)電磁波產(chǎn)生或不產(chǎn)生生物學效應的總體分析，尋找出哪些參數(shù)電磁波會產(chǎn)生細胞Ca2+的生物學窗效應并對其規(guī)律進行歸納總結，特別注意癌細胞相對于正常對照細胞所表現(xiàn)出的不同窗效應特性。

我們采用的熒光探針 (試劑)為Fluo-3，由于 Fluo-3為極性大的酸性化合物，難以進入細胞，而當其結合親脂的乙酰羥甲基酯(Acetoxymethyl Esters，AM) 成為脂溶性Fluo-3/ AM，再與細胞孵育時，很容易透過細胞膜。電磁波對細胞樣品的作用是通過TEM小室來實現(xiàn)的。采用TEM小室是為了獲得在較大范圍內參數(shù)一致的、被屏蔽的均勻平面電磁波，這樣，既便于進行準確的生物電磁劑量估計，又可使各樣品處于相同的、不受外界干擾的輻照環(huán)境中。

實驗研究表明，癌細胞表現(xiàn)出的窗效應相對于正常細胞有其類似的一面，但也顯示出明顯差異。具體表現(xiàn)為：在頻率為16Hz、強度為42.5V/m的電磁波作用下，肝癌細胞和正常對照肝細胞均會出現(xiàn)胞內Ca2+濃度明顯改變的（頻率）窗效應，但肝癌細胞在同樣強度、頻率為45Hz的電磁波作用下也會出現(xiàn)窗效應，而正常肝細胞在該頻率電磁波作用下則不會出現(xiàn)窗效應。

(3)特定參數(shù)電磁波協(xié)同化療藥物作用對提高癌細胞選擇性殺傷效果的實驗研究。首先分別培養(yǎng)各種正常細胞和癌細胞樣品株，對正常細胞和癌細胞分別加化療藥物后將這些樣品放在該癌細胞可產(chǎn)生生物窗效應（對正常細胞不會有窗效應）的電磁波照射系統(tǒng)中接受電磁波輻照。選擇不同時間點觀察電磁波協(xié)同化療藥物作用下對正常細胞的殺傷情況和癌細胞凋亡的情況，研究電磁波協(xié)同改善化療敏感性的條件和方法；對選擇性誘導癌細胞凋亡、相對減輕正常細胞損傷的效果做出評價。

窗效應的產(chǎn)生取決于施加的脈沖場強、脈沖時間、細胞大小、細胞種類以及懸浮液或周圍組織的條件。通過電脈沖聯(lián)合低劑量順鉑治療異種移植人卵巢癌SKOV_3裸鼠，取得了很好的療效，為特定參數(shù)電磁波協(xié)同化療藥物作用對提高癌細胞選擇性殺傷效果的應用打下了基礎。實驗表明：高幅度電磁波對腫瘤具有較強的抑制作用，其對腫瘤的治療作用具有選擇性，這種選擇性與腫瘤組織的特性以及腫瘤細胞的生物學特性有關。實驗中采用的藥物劑量遠遠低于常規(guī)化療劑量，并且在腫瘤部位直接給藥，減少了藥物總量以及藥物的全身循環(huán)，毒副作用小。通過對化療后的裸鼠腎臟做病理檢察表明：低劑量藥物未造成裸鼠腎功能的損傷。高幅度電脈沖對腫瘤血管的生長具有明顯抑制作用。經(jīng)電場處理的腫瘤表面幾乎無血管分布，而未經(jīng)電場處理的腫瘤表面血管豐富。采用免疫組化法檢測腫瘤病理切片中血管內皮生長因子VEGF受體KDR的表達，經(jīng)電場處理的腫瘤的VEGF受體KDR明顯下降，腫瘤血管的生長受到明顯的抑制。說明高幅度電場抑制了腫瘤血管的生長，減少或完全切斷了腫瘤的營養(yǎng)供應，促使腫瘤細胞凋亡或壞死，達到了治療腫瘤的目的。

在利用特定參數(shù)電磁波協(xié)同化療藥物作用對提高癌細胞選擇性殺傷效果時應該選擇合適的脈沖參數(shù)。

6 研究特色

(1)通過大量實驗，可以系統(tǒng)研究電磁波作用于不同癌細胞和正常對照細胞株時胞內Ca2+運動的生物學窗效應規(guī)律，也為進一步探討其發(fā)生機理提供了更好基礎。

(2)在特定參數(shù)電磁波協(xié)同化療藥物的作用下，研究增強化療藥物對癌細胞選擇性凋亡誘導能力的方法。這些研究的開展，可以為克服臨床化療中存在的困難提供新途徑。

(3)建立和改進了癌細胞株在電磁場干預下化療藥物誘導凋亡的體外細胞研究模型。我們建立的模型相比傳統(tǒng)方法有抗藥性程度高、性能更穩(wěn)定的特點。

(4)動物實驗和臨床研究中的一些問題，涉及電磁波應用于動物或人體時的使用方法、身體介質衰減和體內分布估計，電磁波協(xié)同化療藥物作用時的時間和效果分析。

7 總結

本項目擬研究電磁波的生物效應對腫瘤化療增敏的效果與其作用的機理，旨在提高腫瘤化療治療效果的新途徑，屬探索性基礎研究。但因此項目涉及提高社會資源消耗極大的腫瘤醫(yī)療效率提高的問題，所以，即使在項目研究進展上取得很小的突破，也將具有極廣闊的經(jīng)濟與社會前景，對腫瘤化療的治療效果產(chǎn)生深遠的影響。

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Discussion about the Biological Applications of Electromagnetic Waves in Sensitizing Tumors during Chemotherapy

ZHANG En-ke1a,ZHANG Yao-chan2, MA Chan-guo1b

1a.Equipment Management Department; 1b.Radiotherapy Department, Shaanxi Provincial People's Hospital, Xian Shaanxi 710068,China;2. Central Blood Station of Xi'an, Xi'an Shaanxi 710061, China

Chemotherapy is a primary clinical treatment for cancer, but its lack of selective sensitivity and severe side effects limit its widespread use and application. This paper explores the use of experimental techniques in biology and electrical engineering. Based on the observation that electromagnetic waves control tumors, we study how these waves help with sensitization during chemotherapy, and how this may lead to a new way to improve chemotherapy treatments for cancer.

biological effect;chemotherapy;sensitization;electromagnetic wave

Q691.5；R730.53

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2010.06.010

1674-1633(2010)06-0030-04

2009-12-29

2010-03-26

陜西省2008年自然科學研究資助項目(SJ08-2T10)資助。

本文作者：張恩科，副主任技師，陜西省人民醫(yī)院設備管理科副主任。

作者郵箱：zhangenke@163．com