劇榮森，郭昭慶

（1.北京市中關村醫(yī)院骨科，北京 100190；2.北京大學第三醫(yī)院 骨科，北京 100191）

脊柱融合（spinal fusion）手術于 1911年由Albee和Hibbs首次報道，目前已經成為脊柱外科手術治療的一種常用方法。由于脊柱融合是一個多因素的復雜過程，臨床缺少可靠的非損傷性技術對融合的成功與否進行評價，因此很難研究單個因素對脊柱融合的影響。1913年Albee首次使用動物模型進行脊柱融合研究。近些年來，隨著骨組織工程和基因治療的興起以及微創(chuàng)技術的使用，脊柱融合的實驗研究得到了快速的發(fā)展。下面就脊柱融合的實驗研究做一綜述。

1 脊柱融合的實驗動物的選擇

脊柱融合的動物模型根據研究的內容不同，主要分為兩類：生物力學模型和生物學模型。生物力學模型是研究脊柱的生物力學情況或脊柱器械的應用情況，選擇較大的動物模型比較適合，例如犬、羊、猴等，因為脊柱的大小和骨性解剖與人類的脊柱比較接近，獲得的數據更可靠和實用；而生物學模型是研究脊柱融合的生物愈合過程和愈合機制，利用小的動物模型（例如鼠）可以獲得大量的數據，比利用大的動物模型獲得少量的數據要有價值。

1.1 鼠

鼠作為脊柱融合的實驗動物開始應用于評價藥物對脊柱融合的整體作用，近年來主要用于在組織工程和基因治療在脊柱融合的研究。由于裸鼠無免疫原性，在組織工程骨的研究中更為常用。Radall［1］用腺病毒（adenovir）作載體體外轉染攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9（rhBMP-9）的骨髓基質干細胞（hMSC），然后注射到裸鼠椎旁肌，8周后可見脊柱融合。Alden等［2］將含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的腺病毒經皮直接注入裸鼠的腰椎間隙，12周后CT掃描和組織學檢查發(fā)現在所有注入部位均有新骨形成，椎體被融合在一起。

1.2 兔

兔是腰椎解剖與人類相似的最小動物之一，其骨性解剖部位可以提供足夠的空間進行移植物植入，同時能夠提供足夠的髂骨進行自體骨移植對照，而且兔的融合率與人相似，可以有效地比較不同誘導材料的成骨活性，而且，兔的開放性很強，便于飼養(yǎng)和維護，有很高的成本效應比。多用于單節(jié)段胸腰椎融合，多采用橫突間融合模式，Boden等［3］用浸有骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）的膠原海綿放置在新西蘭大白兔的去皮質后的L4-L5橫突間隙，10周后可見堅固的橫突間融合。Feiertag MA等［4］用42只新西蘭大白兔實施自體髂骨塊移植橫突間融合，實驗組術后使之積極活動，對照組術后不人為干擾其活動，結果實驗組融合率只有13％，而對照組融合率有50％，二者差異有顯著性。

1.3 犬

犬模型被用來詳細研究骨移植替代物，骨生長因子。研究人員已經研究出多種不同犬的融合模式，其中包括腰椎和胸椎后橫突間融合與前椎間融合。David SM等［5］用成年比格犬行雙側L4-5橫突間融合比較了rhBMP-2結合I型膠原和聚乳酸做載體對脊柱融合的效果，結果顯示rhBMP-2結合I型膠原可產生100％融合率且無不良反應。Meyer［6］應用犬對BMP-2因子的安全性進行了有益的探討，20只成熟獵犬均行L5雙側椎板切除術，并刺破硬膜，使腦脊液外漏 實驗動物隨機分為兩組，分別植入自體骨及復合rhBMP-2的骨移植材料，研究者發(fā)現：BMP-2組可以促進椎板切除處骨愈合，并且在鞘膜囊及脊髓處無異常礦化。

1.4 羊

包括綿羊和山羊。綿羊模型用于前路的頸椎和腰椎融合、側后方腰椎融合，椎間孔椎間融合（TLIF ）和內窺鏡胸腰椎融合。Kandziora等［7］使用綿羊頸前路減壓融合模型比較了不同的生長因子對脊柱融合術的影響，結果顯示胰島素樣生長因子（IGF）-1/轉化生長因子（TGF）-1和重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）-2都顯著增加脊柱融和的生物力學穩(wěn)定性。山羊是頸椎前路椎間融合研究中最理想的實驗動物。山羊具有頭部直立、頸椎垂直負重等特點，脊柱融合的生物力學環(huán)境與人體相似，而且山羊的椎間盤和椎體的大小也與人類似，能夠有效地比較植入物在人體的情況，Zdeblick等［8］多次成功的用山羊模型做了頸椎前路椎間盤切除融合的實驗。

1.5 豬

豬已被用于頸椎，胸椎和腰椎融合模型。最常用于前路脊柱融合。1994年，Rubino等［9］開發(fā)了一種內鏡下前路頸椎和上胸椎的手術模式。證明在內鏡幫助下，可以清晰地暴露顯示C1-T3的椎間盤，所有的豬都能很好的耐受手術，術后驗尸報告顯示手術部位準確、減壓效果確切。Li等［10］設計了一個實驗，以評估椎間盤組織對椎間融合的影響。用豬行前路腰椎間融合，實驗組完全去除椎間盤組織，使用椎間融合器與自體髂骨作椎間融合，對照組僅用自體髂骨作椎間融合而保留部分自體髓核。結果實驗組取得70％的融合，而對照組的融合率只有10％。從而表明椎間盤切除對椎間融合是必要的。

1.6 猴（非人類靈長類動物）

非人類靈長類動物是和人類表型最相似的動物，分享98％的遺傳同質性。靈長類動物脊柱解剖于人類非常相近，尤其是在腰椎。最常見的實驗用靈長類動物是獼猴和恒河猴。由于猴比較珍貴，往往是用于新型脊柱融合技術、生長因子、以及其他骨移植的替代品臨床前的終末期研究。Hecht等［11］用圓柱形同種異體皮質骨塊和浸有rhBMP的膠原海綿在獼猴身上行L7-S1前路椎體間植骨融合，8周后融合率100％ 。Boden等［12］用21只恒河猴做雙側腰椎橫突間融合實驗，其中16只用后路開放性手術，5只用借助內窺鏡的側后方入路微創(chuàng)手術，用羥基磷灰石-磷酸三鈣（HA-TCP）與rhBMP-2做植入物，結果表明羥基磷灰石-磷酸三鈣（HA-TCP）與rhBMP-2做植入物融合率100％，而兩種手術方式融合效果無差別。

2 脊柱融合動物實驗的手術方法

根據手術創(chuàng)傷的大小，可分為兩類：開放性手術和微創(chuàng)性手術。根據融合部位不同可分為：經前方椎體間融合；經后方椎體間融合、棘突間融合；后外側橫突間、椎板間融合、關節(jié)突間融合。不同的手術方法應用于不同的實驗目的。不同類型的融合技術由于局部解剖結構和血液供應的差異，愈合的過程和愈合的結果存在很大差異。椎體間脊柱融合能提供相對較大的移植空間，移植物血液供應豐富，移植物同時受到較大的機械應力負重，而橫突間脊柱融合提供的空間相對較小，去皮質后對移植物的血液供應比椎體間相對少，特別是在移植物的中央部位沒有直接的血液供應，需要血管再生化。研究中最常用的脊柱融合技術是前方椎體間融合和后外側橫突間融合。最常用的脊柱節(jié)段是頸椎和腰椎。頸椎多采用椎體間融合技術；腰椎節(jié)段采用椎體間和橫突間兩種脊柱融合技術。選用胸椎節(jié)段脊柱融合，可以利用胸椎節(jié)段內在的穩(wěn)定性，避免脊柱不穩(wěn)定對融合產生影響［13］。

開放性手術可滿足所有的融合部位的需要。但傳統開放性手術有三大主要缺陷：肌肉去血供和去神經化，供區(qū)并發(fā)癥和假關節(jié)形成。而微創(chuàng)手術可以減少或消除這些弊端。微創(chuàng)手術可分為經皮穿刺和小切口手術，后者常借助腹腔鏡或內窺鏡的幫助。經皮穿刺手術一般用在鼠，用以研究骨生長因子對脊柱融合的促進作用。A lden TD等［14］用腺病毒作載體體外轉染骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2），然后經皮注射到裸鼠腰骶肌旁，證明基因治療對脊柱融合是有用的。微創(chuàng)手術在報道中常借助內窺鏡，應用于前路椎間融合和后外側橫突間融合。Boden等［3］在用兔和猴研究浸有骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 （rhBMP-2）的膠原海綿促進橫突間融合實驗中，通過對比得出了借助內窺鏡的微創(chuàng)手術和開放性手術對橫突間融合有一樣的效果。具體微創(chuàng)手術過程如下：在L4-L5水平中線兩側各開一個1.5～2.0 cm的切口，借助一個帶有30度鏡頭的光纖導管，在顯示器監(jiān)視下用一彎曲的微型擴張器通過多裂肌和最長肌間隙進入暴露橫突，通過中空管鞘置入一枚直徑5 mm的鉆頭，對局部橫突去皮質，再通過一中空工作管置入浸有骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（rhBMP-2）的膠原海綿微塊，可吸收縫線縫合穿刺切口。Riley等［15］用小型豬對比了借助腹腔鏡微創(chuàng)與開放性手術行前路L7-S1單節(jié)段椎體融合的效果，結果顯示雖然借助腹腔鏡前路可以完成腰骶椎融合，但其術后融合骨塊的生物力學尚沒有達到開放性手術融合的效果。其微創(chuàng)具體過程如下：往腹腔打入15 mmHg氣壓造成氣腹，在腹腔建立標準的五個入口，通過不同的入口分別用18號穿刺針經皮穿刺導出膀胱內尿液，用一枚腹腔釘和腹腔鉗將排空的膀胱推至右側腹壁外，遠離腰骶聯合處；牽開血管；充分暴露腰骶聯合處，通過腹腔鏡配套的刮匙、骨鑿、咬骨鉗去除椎間盤，高速磨鉆使上下終板去皮質化，最后放入植入物。筆者尚未查到后外側入路行腰椎體間融合的微創(chuàng)動物實驗，但在動物身上進行的PLDD（經皮椎間盤激光減壓術）的手術入路可資借鑒：游箭等［16］用犬進行L3～4、L4～5、L5～6三節(jié)段的PLDD，入路如下：犬取右側臥位，在透視下選定進針平面，采用左側距正中線5～7cm作為穿刺點，透視監(jiān)視下穿刺椎間盤，透視正側位對比，正位針尖達棘突水平，側位針體平行于椎體上下緣，針尖達中后/3水平，臨床上郭江等［17］介紹了一種經皮穿刺放置可膨脹式椎間融合器行椎間融合的新技術，其手術入路同PLDD及髓核切吸術相同：從L4-5間隙水平中線旁開8 cm作為穿刺點，通過腰大肌旁肌間隙向L4-5椎間盤進針，逐層上套管，固定 6 mm工作套管于纖維環(huán)內，經此通路，鉗取和吸出椎間隙髓核組織；用長柄中空方形括匙刮除軟骨終板及部分骨性終板，直到上下椎體表面出血。隨即將 4 g異體骨塊，用植骨器壓入椎間隙內，再將帶安裝手柄的內固定，由以色列Disc2O2Tech公司生產的 B2TW IN器械送入椎間隙內，旋轉安裝手柄逐段膨脹，取出安裝手柄。

3 脊柱融合的移植物的選擇

在脊柱融合的實驗研究中，多種材料曾被應用。可分為兩類：天然骨和人工骨。

3.1 天然骨

天然骨移植物包括自體骨和異體骨，異體骨又有同種異體骨和異種骨之分。自體骨移植因為同時具有骨誘導、骨傳導、骨形成作用，融合率高且無免疫反應一直被視為脊柱融合移植物的“金標準”，但自體骨移植存在很多問題。最大的問題是供骨區(qū)的并發(fā)癥，如感染、骨折等，此外，臨床上有一些病人無法取到足夠的自體骨，如骨代謝、骨腫瘤病人。異體骨移植雖可以避免取自體骨所造成的并發(fā)癥，骨量也可以得到滿足，但異體骨最大的問題是骨生長能力低，被吸收率高，血管化程度低，導致融合率低，此外，異體骨還有傳染疾病，引起宿主炎性或免疫排斥反應的危險。以上種種限制了天然骨作為脊柱融合移植物的應用。

3.2 人工骨

也稱組織工程骨。包括3個基本要素：（1）種子細胞（2）誘導成骨因子（3）合適的生物材料支架載體。

3.2.1 種子細胞：具有成骨潛能的細胞都可以用來做種子細胞，包括骨髓基質細胞、成骨細胞、成纖維細胞、肌原細胞等。其中骨髓基質細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）應用最多，它可向骨細胞、軟骨細胞分化，并能經體外培養(yǎng)大量擴增，有望成為骨組織工程最為理想的種子細胞。體外分離培養(yǎng)多取自實驗動物如大鼠斷開的股骨以DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，制成細胞懸液，離心、洗滌后，加入胎牛血清培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代使用。

3.2.2 誘導成骨因子：Urist［18］在1965年的研究中顯示了脫鈣骨基質中的某種物質具有骨誘導能力，后來這種蛋白物質被提純命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogenetic proteins，BMPS），以后人們又陸續(xù)發(fā)現了很多具有誘導骨生成的因子，包括LIM礦化蛋白（LIM m ineralization protein，LMP）、成纖維細胞生長因子-2（fibroblast grow th factor-2，FGF-2）、胰島素樣生長因子 （insulinlike growth factor，IGF）、生長分化因子-5（growth and differentiation factor-5，GDF-5）、血管內皮生長因子等。研究應用最多的還是BMP。目前，BMP家族現已分離純化了 20種蛋白，其中最重要的是BMP-2。BMP-2具有促進成骨細胞分化和誘導體外成骨的能力，同時具有使成骨細胞的前體細胞定向分化為成骨細胞的能力。BMP誘導成骨需3個條件：①達到有效BMP濃度，②存在BMP的靶細胞群：體內骨髓中誘導性成骨細胞、結締組織中未分化、有活力的間充質細胞、成纖維細胞、骨膜細胞等，③允許骨生長的正常環(huán)境。Schimandle［19］首次將rhBMP-2用于后外側橫突間脊柱融合動物模型中，所有rhBMP-2組達到100％堅強脊柱融合，生物力學檢測rhBMP-2組強度和硬度均超過自體骨組。BMP在不同部位的異位誘骨能力是不同的。Okubo［20］將5 lg rhBMP復合膠原后植入大鼠體內不同部位，測試hBMP在體內不同部位的異位誘骨能力，測試部位包括肌肉內、肌間、皮下和脂肪，結果發(fā)現在所有部位都有異位骨生成，而植

入肌肉內的誘骨情況最好，脂肪內的情況最差。最近的實驗表明聯合兩種BMP單體比比單獨使用一種單體更有誘導活性。研發(fā)現 rhBMP-2/rhBMP-7、rhBMP-4/rhBMP-2骨誘導活性是rhBM2活性的5～10倍［21］。BMP極易在局部組織中迅速降解或隨體液擴散流失，單獨應用達不到誘發(fā)骨生長的目的，復合生物載體可減緩它的釋放，增加它的效果。

3.2.3 合適的生物材料支架載體：生物載體應發(fā)揮的作用包括：提供骨細胞生長的支架，誘導骨生長，減緩骨誘導因子的釋放。理想的載體材料應當具有以下特點：①生物相容性較好。②無細胞毒性。③無抗原性或抗原性較低。④生物降解與新骨形成同時進行，對新骨形成無影響。⑤尤其負重部位骨缺損要求移植物有一定機械強度。⑥易消毒和貯藏。組織工程骨載體按形態(tài)和用法可分為兩大類：固態(tài)和液態(tài)。固態(tài)載體無法注射應用，而液態(tài)載體可注射使用。

3.2.3.1 固態(tài)型（不可注射）載體：包括磷陶瓷（calcium phosphate ceramics，CPC）、脫蛋白骨 AOB、多乳酸多羥基乙酰共聚物（PLA/PGA）、不溶性非膠原蛋白（iNCP）、骨基質明膠（BM）、聚乳酸（PLA）等，近年來鈣磷陶瓷由于有良好的骨傳導性研究越來越多。CPC主要包括三種形式：羥基磷灰石（hydroxyapatite）、磷酸三鈣（tricalcium phosphate）和碳酸鈣（calcium carbonate）。三種形式各有特點：羥基磷灰石化學成分類似于骨的礦化基質成分，具有很好的生物相容性，沒有系統毒性，沒有炎性或異物反應。羥基磷灰石移植到體內骨性環(huán)境中能夠與宿主骨產生緊密的結合［22］。但羥基磷灰石有其致命的缺點：脆、張力低、不能生物降解；磷酸三鈣有良好的生物降解性；而碳酸鈣吸收率最高。為了充分利用各種材料的優(yōu)點，新興復合載體的研究越來越受重視。馬興，胡蘊玉等［23］使用顆粒型聚乳酸-聚羥乙酸/磷酸三鈣［PLGA/TCP］與牛bBMP復合成人工骨進行兔椎板間多節(jié)段脊柱融合，結果顯示仿生活性人工骨誘導兔椎板間多節(jié)段的脊柱融合獲得成功，其融合率明顯高于自體髂骨移植。張余、尹慶水等［24］用復合珊瑚羥基磷灰石人工骨用犬做頸椎椎間融合，結果人工骨比自體骨的融合效果好。

3.2.3.2 液態(tài)型（可注射型）載體：可注射型載體可以采用局部注射的方式應用，從而避免手術創(chuàng)傷及手術并發(fā)癥，具有廣闊的應用前景。如、纖維蛋白粘合劑（FS）、膠原（collagen）、藻酸鹽（alginates）、角鯊烷（squalane）聚乙烯吡咯烷酮（PV P）以及可注射性磷酸鈣、硫酸鈣、藻酸鈣骨水泥等。纖維蛋白是血液在正常狀態(tài)下凝固的終產物。其單體在凝血酶作用下聚合成具有可塑形性、可黏附性、可降解性及生物相容性的立體網狀結構，還可調節(jié)從液態(tài)轉變?yōu)槟z的時間［25］。膠原為纖維的組成部分，是細胞外基質 ECM的重要成分，可用做骨軟骨細胞的培養(yǎng)基質。膠原具有適宜的微孔徑、較好的滲透性，適于營養(yǎng)物質、生物因子擴散及血管長入。藻酸鹽是一類從褐藻中提取的天然化合物，作為載體，有很好的優(yōu)越性：承載細胞量大，細胞接近體內的生活狀態(tài)，可進行營養(yǎng)和代謝物質的交換，有利于細胞基質的分泌和濃度的保持。目前，可注射型載體在骨修復的實驗研究較多，而在脊柱融合方面的實驗鮮有報道。劉通方、劉建等［26］在小鼠肌袋用注射型磷酸鈣骨水泥 /纖維蛋白膠復合BMP，結果證明在充分發(fā)揮纖維蛋白對 BMP緩釋作用的同時又使載體獲得了良好的機械性能。李民、周躍等［27］應用可注射硫酸鈣按1∶1混合自體松質骨粒為植入物在狗行前路L3/4、L5/6椎間融合，比較自體髂骨塊為植入物的椎間融合，在術后 12周時，椎間隙基本融合，與自體髂骨融合相似。

建造組織工程骨的方式有以下三種［28］：①支架材料與成骨細胞；②支架材料與生長因子；③支架材料與成骨細胞與生長因子。用新型支架材料與生長因子復合做人工骨移植似乎是脊柱融合實驗的熱門［23-25，27］。

4 脊柱融合實驗的新領域——基因治療

隨著分子生物學和基因組學的快速發(fā)展，可以預見基因治療將成為未來的發(fā)展方向。基因治療方法包括基因轉移 （gene transfer）和基因轉染（gene transfection）?；蜣D移也稱為體內轉移，即 in vivo方法，是將帶有目的基因的載體直接注入體內?；蜣D染也稱為體外轉移，即ex vivo方法，是體外細胞培養(yǎng)，轉染目的基因后再注入體內。脊柱融合實驗包裝基因的載體是基因治療必不可少的部份，目前，基因轉染載體分為兩大類：非病毒載體和病毒載體。非病毒載體包括質粒、脂質體、基因槍和裸露的DNA。目前大多數高效載體是病毒載體，包括反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒和慢病毒、其中以前二種載體較常用。Alden等［2］將含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的腺病毒經皮直接注入裸鼠的腰椎間隙，12周后CT掃描和組織學檢查發(fā)現在所有注入部位均有新骨形成，椎體被融合在一起。Radall等［1］用腺病毒作載體體外轉染攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9（rhBMP-9）的骨髓基質干細胞（hMSC），然后注射到裸鼠椎旁肌旁，8周后可見脊柱融合。

雖然脊柱融合的基因治療取得了大量的成果，但不能否認的是基因治療尚處于起始階段，基因治療中存在的不可控性和基因突變等問題尚需要長時間的觀察。所以，要將基因治療用于臨床脊柱融合修復還需要更深入的研究。

5 脊柱融合實驗的評價方法

一種新的脊柱融合技術或移植物能否達到確切的脊柱融合要求，要有客觀的評價方法。目前世界上公認的評價方法有以下幾種：（1）生物力學檢查：包括融合骨塊的目測法，雙盲的觸診法，力學測試儀測試：包括壓縮、牽拉、彎曲和扭曲力學測試；（2）影像學檢查：包括對融合動物局部的普通X-RAY攝像、CT攝像檢查觀察對比脊柱融合情況；（3）組織學檢查。另外，掃描電鏡和透射電鏡檢查、骨密度測試以及三維微CT檢查也被用到［29］。

脊柱融合從報道到現在已將近100年，要減少組織損傷所帶來的并發(fā)癥，微創(chuàng)手術是發(fā)展方向；椎間融合因為植骨面積大、融合率高、對脊柱生理曲度的矯正效果好仍是首選的手術方式；脊柱融合骨移植物的選擇方面，新型可注射型生物載體復合BMP的人工骨是趨勢。如何用最小的創(chuàng)傷、最少的手術并發(fā)癥的方法來達到最有效的脊柱融合效果從而造福人類是脊柱融合實驗根本的出發(fā)點。

［1］ Dumont RJ，Dayoub H，Li JZ，et al.Ex vivo bone morphogenetic protein-9 gene therapy using human mesenchymal cells induces spinal fusion in rodents［J］.Neurosurgery，2002，51（5）：1239-1244.

［2］Alden TD，Pittman DD，Beres EJ，et al，Percutaneous spinal fusion using bone morphogenetic protein-2 gene therapy［J］.Neurosurg，1999，90（1）：109-114.

［3］ Boden SD，Moskovitz PA，Morone MA，et al.Video-assisted lateral intertransverse process arthrodesis：Validation of a new minimally invasive lumbar spinal fusion technique in the rabbit and nonhuman primate（rhesus）models［J］.Spine，1996，21 （22）：2689-2697.

［4］ Feiertag MA，Boden SD，Schimandle JH，et al.A rabbitmodel for nonunion of lumbar intertransverse process spine arthrodesis［J］.Spine，1996，21（1）：27-31.

［5］ David SM，Gruber HE，Meyer RA Jr，et al.Lumbar spinal fusion using recombinant human bone morphogenetic protein in the canine.A comparison of three dosages and two carriers［J］.Spine，1999，24（19）：1973-1979.

［6］ Meyer RA，Jr Gruber，HE Howard BA，et al. Safety of recombinant human bone morphogetic protein-2 after spinal laminectomy in the dog［J］.Spine，1999，24（8）：747-754.

［7］Perka C，Spitzer RS，Lindenhayn K，et al.Matrix-mixed culture： new methodology for chondrocyte culture and preparation of cartilage transplants［J］.Biomed Mater Res，2000，49（3）：305 -311.

［8］Zdeblick T，Wilson D，Cooke M，et al. Anterior cervical discectomy and fusion.A comparison of techniques in an animal model［J］.Spine，1992，10：S418-S426.

［9］ Rubino F，Deutsch H，Pamoukian V，et al.Minimally invasive spine surgery：an animal model for endoscopic approach to the anterior cervical and upper thoracic spine［J］.J Laparoendosc Adv Surg Tech A，2000，10（6）：309-313.

［10］ Li H，Zou X，Laursen M，et al.The influence of intervertebral disc tissue on anterior spinal interbody fusion：an experimental study on pigs［J］.Eur Spine J，2002，11（5）：476-481.

［11］ Hecht B，Fischgrund J，Herkowitz H，et al. The use of recombinant human bone morphogenetic protein 2 to promote spinal fusion in a nonhuman primate anterior interbody fusion model［J］.Spine，1999，24（7）：629-636.

［12］ Boden S，Martin G，Morone M，et al.Posterolateral lumbar intertransverse process spine arthrodesis with rhBMP-2/ hydroxyapatite-tricalcium phosphate after laminectomy in the nonhuman primate.［J］.Spine，1999，24（12）：1179-1185.

［13］ Emery SE.Fuller DA.Stevenson S.Ceramic anterior spinal fusion.［J］.Spine，1996，21（23）：2713-2719.

［14］Alden TD，Pittman DD，Beres EJ.et al.Percutaneous spinal fusion using bone morphogenetic protein-2 gene therapy［J］.Neurosurg，1999，90（1 Suppl）：109-114.

［15］Riley LH 3 rd，Eck JC，Yoshida H，et al.Laparoscopic assisted fusion of the lumbosacral spine：A biomechanical and histologic analysis of the open versus laparoscopic technique in an animal model［J］.Spine，1997，22（12）：1407-1412.

［16］ 游箭，廖順明，丁仕義.經皮腰椎間盤激光減壓術的早期實驗與臨床研究［J］，中國介入影像與治療學，2005，2（1）：48-53.

［17］ 郭江，焦文倉，徐國喜.經皮穿刺腰椎椎間融合術［J］.中國矯形外科雜志，2007，15（13）：1028-1029.

［18］Urist MR.Bone formation by autoinduction［J］.Science，1965，150（698）：893-899.

［19］ Schimand le JH，Boden SD，Hutton WC，Experimental spinal fusion with recombinant human bone morphogenetic protein-2［J］.Spine，20（12）：1326-1337.

［20］Okubo Y.BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest［J］.Development，2000，127（5）：1095-1104.

［21］Sidhu KS，Prochnow TD，Schmitt P，et al.Anterior cervical interbody fusion with rhBMP-2 and tantalum in a goat model.［J］.Spine，2001，1（5）：331-340.

［22］Koyama T，Handa J，Porous hydroxyapatite ceram ics for use in neurosurgical practice.［J］.Surg Neurol，1986 J，25（1）：71-73.

［23］ 馬興，胡蘊玉，熊卓，等.仿生活性人工骨誘導兔椎板間多節(jié)段脊柱融合的研究［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2005，21（7）：491-495.

［24］ 張余，尹慶水，張洪斌，等.復合珊瑚羥基磷灰石人工骨用于頸椎椎間融合的實驗研究［J］.廣東醫(yī)學，2002，23（9）：907 -908.

［25］ 陳克明，劉興炎，葛寶豐，等.纖維蛋白用作 BMP載體的研究［J］.中華骨科雜志，1998，18（4）：234-235.

［26］ 劉通方，劉建，孟國林，等.注射型磷酸鈣骨水泥/纖維蛋白膠作為 BMP注射性載體的可行性研究［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2006，27（14）：1296-1299.

［27］ 李民，周躍，王建，等.可注射硫酸鈣用于腰椎椎間融合的實驗觀察［J］.華南國防醫(yī)學雜志，2007，21（2）：18-20.

［28］ 毛天球，楊維東，陳富林，等.組織工程骨的研究［J］.中國修復重建外科雜志，2003，17（2）：122-124.

［29］ 鄭振耀，秦嶺，唐勝平，等.實驗性脊柱融合術骨與植入物界面融合的評估方法［J］.中國脊柱脊髓雜志，2005，15（7）： 440-442.