吳克偉，楊 芬，3，劉俊齡，馮公侃，李厚金，朱孝峰

(中山大學(xué)腫瘤防治中心1.華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.腫瘤內(nèi)科，廣東廣州 510060; 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510405;4.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所，廣東廣州 510275)

近半個(gè)世紀(jì)以來，肺癌的發(fā)病率及死亡率逐年增加，20世紀(jì)末肺癌已占惡性腫瘤死亡的首位。由于肺癌的初期癥狀不明顯，大部分肺癌患者在確診肺癌時(shí)多屬中晚期，因此化療是最主要的治療手段。多西他賽為紫杉類藥物，通過促進(jìn)微管雙聚體裝配成微管，同時(shí)通過防止去多聚化過程而使微管穩(wěn)定，阻滯細(xì)胞于G2和M期，從而抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和增殖，發(fā)揮其抗腫瘤的作用，已被美國FDA批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌的一、二線治療［1］。然而同其它化療藥物一樣，藥物治療后誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞耐藥限制了其臨床應(yīng)用?；钚匝?reactive oxygen species ROS)是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物的總稱。ROS作為第二信使，在細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)中起著重要作用，近期研究表明ROS及氧化應(yīng)激也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)過量的ROS則被認(rèn)為是一類損傷細(xì)胞的毒性物質(zhì)，可以氧化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2］。Hirsutanols A是從南海珊瑚Sarcophyton tortuosum內(nèi)生菌中分離得到的一個(gè)倍半萜類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式［3］見Fig 1。本研究旨在研究Hirsutanols A對多西他賽敏感及耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的影響，及ROS在其中的作用。

Fig 1 The chemcial structure of Hirsutanols A

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清購自Hyclone公司。

1.1.2 藥物 多西他賽(docetaxel批號:0906281 2)和依托泊苷(VP-16批號:09043031)購自江蘇恒瑞;紫杉醇(palitaxol批號:8F40509)購自Bristol-Myers Squibb;阿霉素(ADM批號:0602E1)和長春新堿(VCR批號:1002V1)購自深圳萬樂。Hirsutanols A (中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院有機(jī)化學(xué)研究所提取純化)原藥以DMSO溶解，配成100 mmol·L－1貯存液，分裝后－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 其他試劑 二甲基亞楓(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCF-DA)、Dihydroethidium(DHE)和 N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cystein NAC)購自Sigma公司;細(xì)胞裂解液購自Upstate生物技術(shù)公司;BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司;化學(xué)發(fā)光劑(ECL)購自Cell Signal公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自 Calbiochem公司 Caspase-3、PARP、GAPDH及抗兔和抗鼠的二抗均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.1.4 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C14及其多西他賽耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/TXT由日本國立癌癥中心小泉史明博士惠贈(zèng)，用含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)于37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.5 試驗(yàn)儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司;紫外分光光度計(jì)(Beckman DU640)、流式細(xì)胞儀(Beckman-Coultet FC500)，Beckman公司產(chǎn)品等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活力檢測 采用常規(guī)MTT法［4］測定腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板(每孔6 000個(gè)細(xì)胞)，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)培養(yǎng)過夜，次日加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入10 μl MTT液(5 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液加入100 μl DMSO，待結(jié)晶溶解后在酶聯(lián)檢測儀上檢測570 nm波長下每孔的OD值，按下列公式求出細(xì)胞存活率及生長抑制率:細(xì)胞存活率/%=(用藥組平均OD值/對照組平均OD)×100%;生長抑制率/%=(1－用藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100%，按BLISS法計(jì)算機(jī)程序求出半數(shù)抑制濃度IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 細(xì)胞凋亡檢測 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，稀釋接種于6孔板中培養(yǎng)，藥物處理后收集細(xì)胞。按Calbiochem公司Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，往細(xì)胞懸液中加入Media binding reagent及Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育15 min。1 000×g離心5 min，棄上清，用冷1× Binding buffer重懸細(xì)胞后加入碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻后用流式細(xì)胞儀檢測檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.3 Western blot檢測Caspase-3和PARP蛋白表達(dá) 分別收集對照組和Hirsutanols A處理24和48 h組的 PC14/TXT細(xì)胞，裂解后蛋白定量并用于Western blot檢測。首先行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)膜，封閉后分別Caspase-3抗體(1∶1 000)、PARP抗體(1∶ 500)及GAPDH抗體(1∶2 000)室溫孵育2 h，再與二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法發(fā)光曝片。

1.2.4 ROS檢測 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，稀釋接種于6孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞未經(jīng)藥物處理或藥物處理不同時(shí)間后，用10 μmol·L－1DCF-DA或5 μmol·L－1DHE染料［5］避光孵育30 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS。

2 結(jié)果

2.1 PC14和PC14/TXT細(xì)胞的藥物敏感性MTT結(jié)果顯示，與PC14細(xì)胞相比，PC14/TXT細(xì)胞對多西他賽、紫杉醇、阿霉素、依托泊苷及長春新堿的敏感性降低，耐藥指數(shù)分別為:4.05、2.35、1.74、1.73、1.50(Tab 1)?？梢奝C14/TXT表現(xiàn)出對多西他賽較高的耐藥性，并呈多藥耐藥性。

Tab 1 Drug sensitivity of PC14 and PC14/TXT cells

2.2 倍半萜類化合物Hirsutanols A對PC14和PC14/TXT細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度的Hirsutanols A處理PC14及PC14/TXT細(xì)胞72 h或用40 μmol·L－1Hirsutanols A處理PC14及PC14/TXT細(xì)胞24、48和72 h，MTT法檢測Hirsutanols A對細(xì)胞的生長抑制率顯示，Hirsutanols A對PC14/TXT細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性，其 IC50值約為28 μmol·L－1，而對PC14細(xì)胞的增殖幾乎不顯示抑制活性(Fig 2)。

2.3 Hirsutanos A誘導(dǎo)PC14/TXT細(xì)胞凋亡 30 μmol·L－1Hirsutanols A處理PC14/TXT細(xì)胞48、72 h后，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示:細(xì)胞凋亡率隨藥物作用時(shí)間延長逐漸增高(Fig 3A)。此外，Hirsutanols A還可以活化Caspase-3和PARP(Fig 3B)。

2.4 Hirsutanols A對PC14和PC14/TXT細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響 使用DCF-DA和DHE熒光染料分別檢測細(xì)胞內(nèi)過氧化氫和超氧陰離子的含量。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，PC14/TXT細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)水平的過氧化氫和超氧陰離子含量分別是PC14細(xì)胞的3.5倍和1.1倍，可見PC14/TXT細(xì)胞較PC14細(xì)胞有更高的基礎(chǔ)ROS水平，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 4A)。用30 μmol·L－1Hirsutanols A處理PC14和PC14/TXT細(xì)胞，PC14和PC14/TXT細(xì)胞中過氧化氫的含量均迅速增加。隨著藥物處理時(shí)間的延長，PC14細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的含量逐漸降低，在藥物處理4 h已恢復(fù)到基礎(chǔ)水平;而PC14/TXT細(xì)胞內(nèi)過氧化氫含量則一直維持較高的水平(Fig 4B)。

2.5 抗氧化劑NAC逆轉(zhuǎn)Hirsutanols A誘導(dǎo)的PC14/TXT細(xì)胞內(nèi)ROS積累及細(xì)胞凋亡 為研究ROS是否為Hirsutanols A誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵因素，我們用1 mmol·L－1自由基清除劑NAC在Hirsutanols A作用之前預(yù)先加入細(xì)胞中。發(fā)現(xiàn)NAC預(yù)處理能完全逆轉(zhuǎn)Hirsutanols A誘導(dǎo)地ROS增加(Fig 5A)和增殖抑制(Fig 5B)，同時(shí)NAC預(yù)處理也阻斷了Hirsutanols A誘導(dǎo)地細(xì)胞凋亡(Fig 5C)。

Fig 2 Effect of Hirsutanols A on the PC14 and PC14/TXT cells's proliferation

3 討論

近年來，隨著多西他賽等第三代抗腫瘤藥物的臨床應(yīng)用，惡性腫瘤化療的效果有了明顯改善。然而腫瘤耐藥性卻是造成腫瘤化療最終失敗的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥是一個(gè)涉及基因突變、相關(guān)耐藥蛋白及酶類的表達(dá)的復(fù)雜生物學(xué)過程。日本國立癌癥中心小泉史明利用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C14通過體外逐漸增加多西他賽濃度的方法誘導(dǎo)建立多西他賽耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/TXT，在隨后耐藥機(jī)制的研究中，研究者［6］發(fā)現(xiàn)這種獲得性多西他賽耐藥與細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白(P-glycoprotein)高表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。P-glycoprotein［7］屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding cassette transporters)蛋白家族，能夠ATP依賴性地將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)與PC14細(xì)胞相對，PC14/TXT細(xì)胞對其他作用機(jī)制各異的化療藥物都表現(xiàn)出不同程度的敏感性降低。因此尋找新的治療靶點(diǎn)用于耐藥腫瘤的治療具有重要意義。

Fig 3 Hirsutanols A induced apoptosis in PC14/TXT cells

Fig 4 Effects of Hirsutanols A on ROS contents in PC14 and PC14/TXT cells

Fig 5 NAC reversed the increase of ROS induced by Hirsutanols A and inhibited apoptosis

倍半萜類化合物是天然產(chǎn)物化學(xué)的重要組成部分。因其在自然界中廣泛分布，數(shù)量龐大，結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多變，倍半萜化合物一直是尋找和發(fā)現(xiàn)天然藥物先導(dǎo)分子，以及其它功能分子的重要源泉，倍半萜化合物的抗腫瘤活性得到廣泛而深入的研究［8］。Hirsutanols A是從南海珊瑚Sarcophyton tortuosum內(nèi)生菌中分離得到的一種倍半萜類化合物，前期研究表明Hirsutanols A的藥理學(xué)活性依賴于其能提高細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hirsutanols A對多西他賽耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/TXT的增殖有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)較好的劑量/時(shí)間依賴關(guān)系，而對PC14細(xì)胞的增殖幾乎不顯示抑制活性。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明Hirsutanols A可以誘導(dǎo)PC14/TXT細(xì)胞發(fā)生凋亡。使用抗氧化劑NAC可以完全抑制Hirsutanols A誘導(dǎo)地增殖抑制及細(xì)胞凋亡，提示ROS在 Hirsutanols A細(xì)胞毒作用中起著關(guān)鍵作用。我們發(fā)現(xiàn)與PC14細(xì)胞相比，多西他賽耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/ TXT中含有更高基礎(chǔ)水平的ROS含量;用Hirsutanols A處理后，PC14細(xì)胞中的ROS含量迅速增加，在藥物處理后4 h恢復(fù)到基礎(chǔ)水平;而PC14/TXT細(xì)胞在藥物處理后一直維持較高的ROS含量。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:耐藥細(xì)胞株P(guān)C14/TXT由于細(xì)胞代謝或遺傳的改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量增高，細(xì)胞內(nèi)還原物質(zhì)如谷胱甘肽等清除一部分ROS為防止其過度增高引起細(xì)胞死亡，可見與PC14細(xì)胞相比，PC14/TXT細(xì)胞消耗了大量的還原性物質(zhì)，使細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力降低，因而不能耐受Hirsutanols A誘導(dǎo)地氧化應(yīng)激從而發(fā)生細(xì)胞凋亡。Trachootham等［9］研究發(fā)現(xiàn)PEITC能通過ROS介導(dǎo)的機(jī)制特異性殺死氟達(dá)拉濱耐藥的慢性淋巴性白血病細(xì)胞株，說明ROS有可能成為耐藥腫瘤細(xì)胞治療的潛在靶點(diǎn)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)倍半萜類化合物Hirsutanols A可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成從而特異性的誘導(dǎo)多西他賽耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株P(guān)C14/ TXT細(xì)胞發(fā)生凋亡。下一步我們將深入研究Hirsutanols A誘導(dǎo)ROS生成的分子機(jī)制，為Hirsutanols A的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

［1］ Belani C P，Eckardt J.Development of docetaxel in advanced nonsmall-cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2004，46(2):S3－11.

［2］ Pelicano H，Carney D，Huang P.ROS stress in cancer cells and therapeutic implications［J］.Drug Resist Updat，2004，7(2):97－110.

［3］ Wang GYS，Abrell L M，Avelar A，et al.New hirsutane-based sesquiterpenes from salt water cultures of a marine sponge-derived fungus and the terrestrial fungus coriolus consors［J］.Tetrahedron，1998，54(26):7335－42.

［4］ 謝松強(qiáng)，李 騫，張亞宏，等.萘酰亞胺－多胺綴合物NNINspm通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(2):169－74.

［4］ Xie S Q，Li Q，Zhang Y H，et al.NNINspm，naphthalimide-polyamine conjugate，induces hepatoma HepG2 cell apoptosis via PI3K/Akt pathways［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(2):169－74.

［5］ 王 巍，安達(dá)正晃，周 晉.ROS在小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)MM細(xì)胞凋亡中的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(1):92－4.

［5］ Wang W，Adachi M，Zhou J.Effect of ROS on parthenolide-induced apoptosis in multiple myeloma cell［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(1):92－4.

［6］ Saijo N，Nishio K，Ohta S，et al.Progress in preclinical and clinical studies for the development of new anticancer drugs in Japan，with emphasis on taxanes［J］.Cancer Chemother Pharmacol，1996，38: S11－5.

［7］ Gottesman M M，F(xiàn)ojo T，Bates S E.Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters［J］.Nat Rev Cancer，2002，2 (1):48－58.

［8］ 李 勇，李鐵庫，溫士旺，等.土木香中純化的五種倍半萜類化合物抑制腫瘤增殖活性的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26 (1):112－5.

［8］ Li Y，Li T K，Wen S W，et al.In vivo and in vitro anti-tumor activity studies of five sesquiterpenoids from Inula helenium［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):112－5.

［9］ Trachootham D，Zhang H，Zhang W，et al.Effective elimination of fludarabine-resistant CLL cells by PEITC through a redox-mediated mechanism［J］.Blood，2008，112(5):1912－22.