袁媛，史新娥，劉月光，楊公社

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 動(dòng)物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100

FoxO家族是一群擁有保守的 Fork區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠和TTGTTTAC序列相似性高或一致的序列結(jié)合，主要參與DNA修復(fù)、細(xì)胞分化、凋亡和代謝[1]。FoxOs作為轉(zhuǎn)錄活化因子，其活性受多條信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，包括胰島素、PI3K/Akt等，其作用方式是對(duì) FoxOs特定的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化/去磷酸化的調(diào)控[2]。FoxOs特異性的氨基酸位點(diǎn)一旦被磷酸化后，將從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，此時(shí)便失去轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，其功能亦被抑制，因此 FoxOs在核內(nèi)外的轉(zhuǎn)位決定了其對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[3]。近幾年的研究表明，該家族成員FoxO1在骨骼肌的分化、生長(zhǎng)與代謝過(guò)程中扮演重要角色，但其調(diào)控方式仍存在爭(zhēng)議，分子機(jī)制尚 不清楚。

3.4 腸道菌群與更年期綜合征 更年期綜合征指部分婦女由于卵巢功能衰退或喪失，因性激素波動(dòng)或急劇減少，引起機(jī)體內(nèi)分泌失調(diào)、免疫力低下和植物神經(jīng)紊亂的癥候群，可導(dǎo)致全身多個(gè)系統(tǒng)的病理變化[28]。近年來(lái)越來(lái)越多研究證明，腸道菌群的改變會(huì)引起體內(nèi)代謝紊亂，且與高級(jí)神經(jīng)精神活動(dòng)存在密切關(guān)系，說(shuō)明腸道菌群改變可能與更年期的一系列癥候群存在一定關(guān)系。郭在清[29]研究結(jié)果顯示，更年期綜合征人群腸道雙歧桿菌數(shù)量顯著減少，腸桿菌科及腸球菌細(xì)菌數(shù)量顯著增加，益生菌群與腸桿菌科結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能更年期綜合征人群由于神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)等健康狀態(tài)的下降，引起腸道有益菌群與腐敗菌比例發(fā)生變化，從而引起腸道微生態(tài)失調(diào)。

豬肉是我國(guó)肉類(lèi)生產(chǎn)的主體，目前提高瘦肉率、改善肉品質(zhì)已成為豬育種的主要研究方向。骨骼肌是肌肉的主要組成部分，其生長(zhǎng)發(fā)育非常復(fù)雜，涉及到大量基因的表達(dá)及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。FoxO1的表達(dá)和活性與骨骼肌的發(fā)育密切相關(guān)，但目前關(guān)于其在肌肉發(fā)育中的調(diào)控方式仍不十分清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的豬原代骨骼肌成肌細(xì)胞分化，檢測(cè)FoxO1在此過(guò)程中的表達(dá)變化，并通過(guò)將FoxO1基因?qū)胴i成肌細(xì)胞，探索FoxO1對(duì)成肌分化的影響，為進(jìn)一步揭示FoxO1調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

這主要是指大斷面淺埋偏壓隧道在開(kāi)始時(shí)要注意控制標(biāo)準(zhǔn)面上下部的每循環(huán)開(kāi)挖尺寸。大體而言，上導(dǎo)洞的每循環(huán)開(kāi)挖尺寸應(yīng)控制在0.5m內(nèi)，下導(dǎo)洞視周?chē)鷰r石的穩(wěn)定情況定位0.5～1m，保證下部落后于上部約5～10m。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

3日齡健康長(zhǎng)白仔豬由西北農(nóng)林科技大學(xué)種豬場(chǎng)提供，體重1.5~2.5 kg，取樣前用0.5%的新潔爾滅清洗0.5 h左右，電擊處死。

1.1.2 主要試劑

含目的基因 FoxO1的 pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒和空質(zhì)粒pcDNA3由Haojie Huang教授 (Minnesota University，USA) 惠贈(zèng)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、Opti-MEM (Invitrogen)、G418 (Gibco)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)、鏈酶蛋白酶 (Sigma)、胎牛血清 (杭州四季青)、馬血清 (Gbico)、Trizol (TaKaRa)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT-reagent Kit (TaKaRa)、DNAseⅠ(TaKaRa)、實(shí)時(shí)定量試劑盒 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time) (TaKaRa)、抗FoxO1、P-FoxO1 (Ser256)、MyoD、β-actin和FLAG抗體均購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司，抗 myogenin 購(gòu)自Millipore公司。其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 豬骨骼肌成肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分化誘導(dǎo)

FoxO1是多條信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理過(guò)程，其活性受到磷酸化/去磷酸化的調(diào)控[5-6]。本實(shí)驗(yàn)室龐衛(wèi)軍及其他學(xué)者的研究表明，F(xiàn)oxO1廣泛表達(dá)于各種組織器官中，包括脂肪、骨骼肌和肝臟等并能夠抑制脂肪細(xì)胞的分化[7-8]。眾多研究證實(shí)，F(xiàn)oxO1在肌肉發(fā)育與分化中起到重要作用。Bois等研究指出FoxO1可以促進(jìn)小鼠原代成肌細(xì)胞的終末分化[9]，同年又有研究發(fā)現(xiàn)C2C12小鼠成肌細(xì)胞系的分化受到FoxO1轉(zhuǎn)錄因子的抑制[10]。Kamei等構(gòu)建了骨骼肌特異的FoxO1轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)骨骼肌重量明顯減少[11]。這些研究均表明，F(xiàn)oxO1轉(zhuǎn)錄因子在骨骼肌的分化中扮演重要角色，但調(diào)控方式仍存在爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。因此，我們首先檢測(cè)了豬原代成肌細(xì)胞分化過(guò)程中FoxO1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在豬成肌細(xì)胞的分化過(guò)程中，F(xiàn)oxO1基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，而總蛋白表達(dá)量變化并不顯著，其磷酸化水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明FoxO1的失活狀態(tài)對(duì)于成肌細(xì)胞的分化是非常必要的。

依照本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法[4]，培養(yǎng)豬原代骨骼肌成肌細(xì)胞。原代細(xì)胞以0.5×106個(gè)/cm2密度接種至六孔培養(yǎng)板內(nèi)，置于 5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)基，此后每隔2 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞匯合至60%~70%時(shí)，將含15%胎牛血清的培養(yǎng)液換成 2%馬血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，持續(xù)培養(yǎng)5 d，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

[3] Van Der Heide LP, Hoekman MF, Smidt MP. The ins and outs of FoxO shuttling: mechanisms of FoxO translocation and transcriptional regulation. Biochem J, 2004, 380(Pt 2): 297?309.

1.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬原代成肌細(xì)胞

原代豬骨骼肌成肌細(xì)胞在含15%胎牛血清和抗生素的 DMEM/F-12培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞轉(zhuǎn)入六孔板，加入含15%小牛血清而無(wú)抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合至 60%~70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，先將4 μg的質(zhì)粒DNA稀釋于250 μL培養(yǎng)基中，再將10 μL的Lipofectamine 2000稀釋于250 μL培養(yǎng)基中，5 min后將二者混合，混勻后室溫放置20 min。更換待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基為Opti-MEM (Invitrogen) 培養(yǎng)基，加入DNA和Lipofectamine 2000的混合物，培養(yǎng)5 h后更換為含15%胎牛血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)基。為了獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，在培養(yǎng)基中添加200 μg/mL的G418，繼續(xù)培養(yǎng)7~14 d，篩選具有G418抗性的細(xì)胞。最后用Western blotting篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。

超前網(wǎng)絡(luò)化：①對(duì)照月度作業(yè)計(jì)劃，基層隊(duì)組三日內(nèi)超前制定網(wǎng)絡(luò)工期表；②各專(zhuān)業(yè)科室對(duì)照網(wǎng)絡(luò)，詳細(xì)列出當(dāng)月超前管理的變化環(huán)節(jié)，進(jìn)行跟蹤落實(shí)；③突出對(duì)超前探測(cè)地質(zhì)變化，準(zhǔn)確掌握構(gòu)造位置、類(lèi)型、產(chǎn)狀等信息，制定相關(guān)安全技術(shù)措施，跟蹤落實(shí)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank已發(fā)表的基因序列 (FoxO1、MyoD、Myogenin、β-actin 的GenBank 登錄號(hào)分別為：NM_214014.2，NM_001002824，NM_001012406，NM_007393)，嚴(yán)格按照實(shí)時(shí)定量引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers for genes

1.2.4 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

按照RNAiso Plus (TaKaRa) 總RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取誘導(dǎo)分化第 0、3、5天的豬原代成肌細(xì)胞的總 RNA，用 DNaseⅠ處理后，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA的完整性并用Nanodrop ND-1000核酸蛋白定量?jī)x對(duì) RNA定量，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

“兩線合一”的劃定是一個(gè)集自然、社會(huì)與經(jīng)濟(jì)的符合生態(tài)系統(tǒng)，本文以生態(tài)控制的視角，將城市開(kāi)發(fā)邊界與生態(tài)安全關(guān)聯(lián)起來(lái)，結(jié)合以往城市“兩線合一”的劃定經(jīng)驗(yàn)，將其分類(lèi)研究，探索“兩線合一”的劃線模式，并以北京城市副中心的“兩線合一”劃定為例，提出“守住底線，總量控制，留有余地”的生態(tài)控制型城市開(kāi)發(fā)邊界與生態(tài)紅線“兩線合一”的劃線方法。

利用Smart Cycler II (Cepheid公司) 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。反應(yīng)總體系25 μL，其中：滅菌的ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL，上游引物(10 μmol/L) 1 μL，下游引物 (10 μmol/L) 1 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (2×) 12.5 μL。采用兩步法PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共45個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)采用2?ΔΔCt公式計(jì)算。

改革和完善農(nóng)村社會(huì)保障制度，既是維護(hù)最廣大農(nóng)民群眾的根本利益的必然要求，也是我國(guó)實(shí)現(xiàn)全面建設(shè)小康社會(huì)目標(biāo)的重要路徑，對(duì)于實(shí)現(xiàn)城鄉(xiāng)統(tǒng)籌，社會(huì)和諧具有極大的重要意義。因此，基于我國(guó)當(dāng)前農(nóng)村公共產(chǎn)品供給現(xiàn)狀，結(jié)合當(dāng)前經(jīng)濟(jì)社會(huì)實(shí)際情況，就完善社會(huì)保障制度的建設(shè)，從三個(gè)方面提出以下一些建議與思考：

1.2.6 Western blotting

伊德里斯的地圖中雅朱者和馬朱者出現(xiàn)在中國(guó)北方(見(jiàn)圖3)，在“亞歷山大邊墻”后面有一塊銘文，寫(xiě)著“屬于包圍雅朱者和馬朱者的庫(kù)法亞(Kufaya)山脈”。邊墻有門(mén)，大門(mén)處標(biāo)識(shí)了亞歷山大的阿拉伯名字杜爾-卡奈因(Dul-Karnai)。

HCY是蛋氨酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，是含硫的氨基酸。有研究發(fā)現(xiàn)，HCY在代謝過(guò)程中損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一[6-7]；致病機(jī)制是由于HCY是中間代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)的不穩(wěn)定性，易產(chǎn)生過(guò)氧化物和氧自由基，啟動(dòng)低密度脂蛋白的過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致腎組織細(xì)胞的損害和凋亡，從而加速病情的進(jìn)展；HCY能促進(jìn)動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生并加快動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成；同時(shí)HCY通過(guò)激活凝血因子和促進(jìn)血小板聚集來(lái)啟動(dòng)凝血功能，降低纖溶活性，從而使增加血栓形成概率。該研究結(jié)果顯示，血清HCY的表達(dá)水平與ACR呈正相關(guān)，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），監(jiān)測(cè)HCY水平有助于判斷DN的發(fā)生發(fā)展。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，PBS洗1遍，每皿加入 200 μL的細(xì)胞裂解液。當(dāng)細(xì)胞充分裂解后，12 000×g離心5 min，取上清，以BradFord方法對(duì)總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。提取的總蛋白95℃加熱10 min，10% SDS-PAGE分離蛋白，接著以200 mA的電流將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，用抗FoxO1、P-FoxO1 (Ser256)、MyoD、myogenin、β-actin和 FLAG的抗體 (1∶200)，4℃孵育過(guò)夜。再與對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗 (1∶2 000)室溫下孵育2 h，最后利用Bio-Rad GS-800曝光系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白，并用Quantity One軟件分析蛋白表達(dá)量。

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件One-way ANOVA進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬原代成肌細(xì)胞的分化

豬原代成肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，貼壁，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形 (圖1A)。2%馬血清誘導(dǎo)分化3 d后，成肌細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，開(kāi)始融合 (圖1B)。誘導(dǎo)分化5 d后，可以看到有肌管形成 (圖1C)。

2.2 豬原代成肌細(xì)胞分化過(guò)程中 FoxO1的表達(dá)變化

檢測(cè)原代豬成肌細(xì)胞FoxO1在分化0、3、5 d表達(dá)的變化。實(shí)時(shí)定量 RT-PCR結(jié)果表明，在豬成肌細(xì)胞分化過(guò)程中，F(xiàn)oxO1 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(圖2A)。然而，Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此過(guò)程中FoxO1總蛋白的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化，但其磷酸化水平顯著增加 (圖2B?D)。

羅恬隱隱覺(jué)得有些不安，趙炎始終沒(méi)有消息，公司里也沒(méi)人知道他去了哪里，電話也打不通。更讓羅恬不安的是，她總覺(jué)得這幢大房子里，還藏著另一個(gè)人。有時(shí)她會(huì)聽(tīng)到一樓傳來(lái)沉悶的腳步聲。有時(shí)會(huì)聽(tīng)到閣樓里“咔咔”的機(jī)械聲，那些莫名響起的聲音，在寂靜的深夜里聽(tīng)起來(lái)格外詭異。

2.3 FoxO1質(zhì)粒成功感染豬原代成肌細(xì)胞的鑒定

原代豬成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒 pcDNA3和pcDNA3- FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒72 h后，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blotting，檢測(cè)FoxO1蛋白表達(dá)情況。如圖3所示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒的豬成肌細(xì)胞中FoxO1表達(dá)顯著提高，同時(shí)也可檢測(cè)到FLAG標(biāo)簽的表達(dá)。

由此，最終確定以下6個(gè)企業(yè)協(xié)調(diào)聯(lián)動(dòng)的關(guān)鍵影響因素：相互依賴(lài)與信任(IT)、不確定性(UC)、企業(yè)文化(EC)、信息溝通與共享(ICS)、利益分享(BS)、政策法律環(huán)境(PLE)。各因素對(duì)企業(yè)之間協(xié)調(diào)聯(lián)動(dòng)機(jī)制實(shí)施效果的影響最終通過(guò)戰(zhàn)略目標(biāo)(SO)和協(xié)調(diào)績(jī)效(CP)指標(biāo)來(lái)反映。

圖1 豬原代成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化形態(tài)圖Fig. 1 Differentiation and morphometric analysis of pig skeletal muscle myoblast differentiation at 0 day (A), 3 day (B) and 5 day (C).

圖2 豬原代成肌細(xì)胞分化過(guò)程中FoxO1的表達(dá)變化Fig. 2 FoxO1 expression pattern during pig myoblast differentiation. Real-time PCR (A) and Western blotting (B) were performed to quantify the the time-course expression of FoxO1 during myoblast differentiation. (C?D) Densitometric analysis of total FoxO1and FoxO1 phospholation normalized against β-actin, respectively. *P<0.05.

圖3 質(zhì)粒成功導(dǎo)入豬成肌細(xì)胞的鑒定Fig. 3 Identification of plasmids transfected into porcine myoblasts successfully by Western blotting.

2.4 FoxO1過(guò)表達(dá)對(duì)豬原代成肌細(xì)胞分化的影響

對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3和pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒的豬成肌細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，觀察誘導(dǎo)分化第5天時(shí)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組空質(zhì)粒在誘導(dǎo)5 d后，細(xì)胞正常分化，并有肌管形成 (圖4B)。然而，過(guò)表達(dá) FoxO1的豬成肌細(xì)胞雖也進(jìn)行分化并呈現(xiàn)梭形生長(zhǎng)，但成肌分化進(jìn)程被明顯推遲，未能形成肌纖維 (圖4D)。

2.5 FoxO1過(guò)表達(dá)對(duì)豬原代成肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因的影響

圖4 高表達(dá)FoxO1推遲豬成肌細(xì)胞的分化進(jìn)程Fig. 4 Over-expression of FoxO1 delayed pig myoblast terminal differentiation. Differentiation and morphometric analysis of pig skeletal muscle myoblast differentiation at 0 day and 5 day in control (A and B) and FoxO1-infected cells (C and D), respectively.

對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3和pcDNA3-FLAG-tagged FoxO1質(zhì)粒的豬成肌細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)，分別檢測(cè)誘導(dǎo)分化第3天 (D3) 和第5天 (D5) 時(shí)，成肌分化早期標(biāo)志基因MyoD和晚期標(biāo)志myogenin的表達(dá)變化。如圖5A所示，對(duì)照組細(xì)胞中MyoD在成肌細(xì)胞早期表達(dá)，分化第 3天達(dá)到峰值，分化末期 (D5) 表達(dá)量回到基礎(chǔ)水平。成肌分化晚期標(biāo)志myogenin隨著分化時(shí)間的推移逐漸升高 (圖 5C)。高表達(dá)FoxO1的豬成肌細(xì)胞中，MyoD 和myogenin mRNA含量均顯著降低 (P＜0.05) (圖 5A、5C)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)FoxO1的豬成肌細(xì)胞中MyoD蛋白表達(dá)量略有下降，但差異并不顯著，而 myogenin蛋白表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄水平保持一致，受到顯著抑制 (圖5B、5D、5E)。

3 討論

After adding metamaterial to the design of simple patch， the structure will be as below:

“地者，政之本也！”土地資源是農(nóng)民賴(lài)以生存的物質(zhì)保證，是生活生產(chǎn)中不可或缺的重要組成部分，土地政策更是盤(pán)活土地資源，帶領(lǐng)農(nóng)民脫貧致富的保證，是精準(zhǔn)扶貧工作穩(wěn)步前行，各項(xiàng)政策落地的物質(zhì)保障。做好土地政策研究、制定與落實(shí)，是盤(pán)活土地資源，釋放土地價(jià)值，助推其他精準(zhǔn)扶貧政策有效實(shí)施的基礎(chǔ)性工作。

圖5 高表達(dá)FoxO1對(duì)豬成肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因的影響Fig. 5 Over-expression of FoxO1 inhibited pig myoblast terminal differentiation. Real-time PCR (A and C) and Western blotting (B and D) showed the changes of early and late myogenic factors (MyoD and myogenin) in control and FoxO1-infected cells. (E) Densitometric analysis of MyoD and myogenin at 5 days differetiation (D5) normalized against β-actin. *P<0.05.

MyoD 和 myogenin屬于生肌調(diào)節(jié)因子家族(Myogenic regulation factors，MRFs)，可激活肌肉的基因轉(zhuǎn)錄，抑制肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)分化，在骨骼肌發(fā)生早期起到重要的調(diào)節(jié)作用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)室楊燕軍等[14]通過(guò)對(duì)不同品種豬背最長(zhǎng)肌的組織差異分析發(fā)現(xiàn)FoxO1和MyoD基因的表達(dá)在肌肉發(fā)育中存在負(fù)相關(guān) (P＜0.05)。為了進(jìn)一步證明 FoxO1在成肌分化中的作用，我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)FoxO1的豬原代成肌細(xì)胞株，并檢測(cè)了早期和晚期成肌標(biāo)志分子MyoD和myogenin的表達(dá)情況。與對(duì)照組成肌細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá) FoxO1的豬成肌細(xì)胞中，MyoD和myogenin基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量受到顯著抑制(P＜0.05)。同時(shí)，Western blotting結(jié)果顯示早期成肌標(biāo)志 MyoD蛋白表達(dá)量雖受到抑制但變化不明顯，然而晚期標(biāo)志myogenin蛋白表達(dá)與其基因表達(dá)保持一致，顯著下調(diào) (P＜0.05)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)oxO1可以通過(guò)抑制早期標(biāo)志基因MyoD推遲成肌細(xì)胞的分化，并進(jìn)一步通過(guò)抑制肌肉形成的晚期標(biāo)志分子myogenin阻遏肌肉的分化。

同時(shí)，生肌調(diào)節(jié)因子不僅在成肌分化中發(fā)揮重要作用，由于其調(diào)控收縮蛋白和調(diào)節(jié)蛋白同工型在不同時(shí)期表達(dá)，也可以促使肌肉細(xì)胞向不同類(lèi)型的肌纖維分化[15-16]。已有研究證實(shí)，MyoD在快肌纖維中優(yōu)先表達(dá)，而myogenin在慢肌纖維中表達(dá)較多[17]。骨骼肌特異的FoxO1轉(zhuǎn)基因小鼠中，慢肌纖維數(shù)量明顯減少而快肌纖維數(shù)量沒(méi)有明顯改變[11]。然而小鼠骨骼肌中特異性地敲除FoxO1可以改變?cè)械募±w維類(lèi)型組成，快肌纖維含量上調(diào)并伴隨慢肌纖維的減少，同時(shí)檢測(cè)到MyoD基因表達(dá)量的增加[18]。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與這些研究一致，表明FoxO1在控制肌纖維分型中也發(fā)揮重要作用，并提示FoxO1可能通過(guò)調(diào)節(jié)生肌調(diào)節(jié)因子控制肌纖維類(lèi)型的分化。然而，對(duì)于FoxO1調(diào)控肌纖維類(lèi)型特異性分化的具體機(jī)制還有待深入研究。

綜上所述，本研究表明FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在豬原代成肌細(xì)胞分化中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，能夠推遲并抑制豬成肌細(xì)胞的分化，并可能參與調(diào)控骨骼肌纖維類(lèi)型的終末分化。

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余傳偉的水彩畫(huà)有一種別樣的氣息。讀他的畫(huà)就如同吟一首民國(guó)時(shí)期的抒情敘事小詩(shī)，感動(dòng)便不經(jīng)意的在心里流淌了，自然、隨性，并隱約有故事。

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如前所屬，本次改造工程只有廠區(qū)西側(cè)的細(xì)長(zhǎng)地塊和東側(cè)廠前區(qū)少量預(yù)留用地可作為深度處理設(shè)施用地，綜合比較，我們選擇占地面積最小、工藝流程最簡(jiǎn)單、運(yùn)行費(fèi)用較低、運(yùn)行管理簡(jiǎn)單的濾布濾池方案作為本工程過(guò)濾方案。

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