任宇，吳海青，馬玉珍,2，倉明，王瑞，劉東軍

1 內(nèi)蒙古大學(xué) 哺乳動(dòng)物繁殖生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021

2 內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院，呼和浩特 010017

牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定

任宇1，吳海青1，馬玉珍1,2，倉明1，王瑞1，劉東軍1

1 內(nèi)蒙古大學(xué) 哺乳動(dòng)物繁殖生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021

2 內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院，呼和浩特 010017

為了給組織工程提供種子細(xì)胞，對(duì)牛間充質(zhì)干細(xì)胞 (Adipose-derived stem cells，ADSCs) 進(jìn)行體外分離培養(yǎng)。首先應(yīng)用膠原酶消化法分離牛ADSCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)、連續(xù)傳代，并觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞壓片進(jìn)行染色體分析，采用細(xì)胞免疫熒光化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記，利用成骨分化和成脂分化檢測(cè)其分化能力。結(jié)果顯示牛ADSCs體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣，增殖穩(wěn)定；Vimentin、CD49d、CD13表達(dá)呈陽性，CD34表達(dá)呈陰性；成骨誘導(dǎo)條件下的細(xì)胞堿性磷酸酶活性高，茜素紅染色呈陽性；成脂誘導(dǎo)條件下細(xì)胞周圍脂滴明顯，油紅-O染色呈陽性。結(jié)果證明牛 ADSCs體外生長(zhǎng)穩(wěn)定、增殖速度快、定向分化能力強(qiáng)，簡(jiǎn)易的體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)方法為其在組織工程中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，體外分離培養(yǎng)，細(xì)胞鑒定，細(xì)胞分化

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成年牛頸部脂肪組織由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶、雙抗、胎牛血清 (以上藥品均由Hyclone公司提供)；Ⅰ型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、Alizarin Red、BSA、牛胰島素、生物素、泛酸、羅格列酮、IBMX、Oil Red-O (以上藥品均由Sigma公司提供)；ALP檢測(cè)試劑盒 (北京中生生物技術(shù)公司) 等。

1.2 方法

1.2.1 牛ADSCs的分離

采用膠原酶解法分離：脂肪組織用PBS沖洗2次，無菌條件下用手術(shù)刀切碎脂肪組織，分裝入50 mL離心管中。加入與脂肪組織等體積的PBS (含有 1% BSA，0.1%Ⅰ型膠原酶)，37℃搖床中振蕩酶解60 min，每隔20 min收集一次細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min，除去上層脂肪組織。最后將3次收集的細(xì)胞移至同一離心管內(nèi)，1 200 r/min離心5 min后棄上清液，基本培養(yǎng)基重懸沉淀，即得到牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。

1.2.2 原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)

按2×105/cm2的接種密度，在60 mm培養(yǎng)皿中加入5 mL基本培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2濃度、飽和濕度條件進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)基，以后隔天換液，當(dāng)貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)達(dá)到80%匯合時(shí)，加入 0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。將擴(kuò)增后的不同代次牛ADSCs，按0.5×106/mL置于冰凍保存管，加入冰凍保護(hù)劑 (10% DMEM，10% DMSO，80% FBS)，置冰凍盒中?80℃冰箱保存24 h后，轉(zhuǎn)入液氮保存。

1.2.3 牛ADSCs鑒定

牛ADSCs以1×105/mL的密度接種于鋪于24孔板內(nèi)的蓋玻片上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上匯合時(shí)，4%多聚甲醛室溫固定 30 min，加入滲透液 (0.1% TritonX-100) 室溫滲透1 h，加入封閉液 (PBS+2% BSA+2%山羊封閉血清+2%脫脂奶粉+0.15 MGlycine) 37℃封閉 2 h，然后分別滴加 1∶200 Vimentin (小鼠抗大鼠多克隆抗體，武漢博士德生物)、CD49d (兔抗大鼠多克隆抗體，武漢博士德生物)、CD34 (兔抗大鼠多克隆抗體，武漢博士德生物)和CD13 (兔抗大鼠多克隆抗體，武漢博士德生物)，37℃溫育2 h。清洗一抗后，1∶50加入山羊抗FITC標(biāo)記二抗37℃溫育2 h，最后PBS+BSA清洗二抗PI染色15 min，同時(shí)以PBS代替一抗和牛成纖維細(xì)胞作為陰性對(duì)照，共聚焦顯微鏡 (BX61，奧林巴斯，日本) 觀察細(xì)胞染色情況。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線

傳代培養(yǎng)的第5、10代細(xì)胞用普通培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，第2天起每天取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)。以時(shí)間 (d) 為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量(×104/mL)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 染色體分析

取第5、10代處于指數(shù)生長(zhǎng)期的牛ADSCs，加入含0.1 μg/mL秋水仙素 (Sigma) 的DMEM-F12培養(yǎng)4 h。0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，逐滴加入37℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl 5 mL，37℃低滲處理20 min。低滲結(jié)束后加入新配制固定液 (甲醇∶冰醋酸= 3∶1) 1 mL，預(yù)固定1 min后1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加固定液懸浮細(xì)胞后靜置30 min，再離心，固定2次，每次30 min。離心后加固定液1.5 mL制成細(xì)胞懸液。用微吸管取細(xì)胞懸液滴于?20℃冰凍的載玻片上，空氣干燥，1∶9姬姆薩(Sigma) 磷酸緩沖液染色 15 min，清水洗滌后顯微鏡下觀察。

1.2.6 成骨分化誘導(dǎo)

培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，置換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3天更換一次新鮮分化培養(yǎng)基 (DMEM/ F12+10% FBS+1%雙抗+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+20 nmol/L地塞米松+50 μg/mL抗壞血酸) 進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。對(duì)照組繼續(xù)加入常規(guī)培養(yǎng)基每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基，與誘導(dǎo)組在同一條件下培養(yǎng)，21 d后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.2.7 成脂分化誘導(dǎo)

培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)板中加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (DMEM/F12+3% FBS+1%雙抗+33 μmol/L生物素+17 μmol/L泛酸+1 μmol/L胰島素+1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+5 μmol/L羅格列酮+ 5%兔血清) 培養(yǎng)3 d，然后換為無羅格列酮和IBMX的維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每 3天更換一次新鮮分化培養(yǎng)基。對(duì)照組繼續(xù)加入常規(guī)培養(yǎng)基每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基，與誘導(dǎo)組在同一條件下培養(yǎng)，21 d后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.2.8 成骨細(xì)胞鑒定

茜素紅染色：誘導(dǎo)培養(yǎng) 21 d的細(xì)胞，用150 mmol/L NaCl沖洗3次，在4℃下用70%乙醇固定1 h，室溫下用2%茜素紅 (NaOH調(diào)pH 4.1~4.3)染色10 min，相差顯微鏡檢測(cè)鈣鹽沉積情況。

堿性磷酸酶(Alkaline phos phatase，ALP)染色：將成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的細(xì)胞PBS沖洗2次，4℃下用 100%乙醇固定1 h，加入NBT/BCIP溶液溫育后檢測(cè)ALP活性。

PCR鑒定骨鈣素 (Osteocalcin) 的表達(dá)：TaKaRa RNAiso reagent裂解成骨細(xì)胞，氯仿抽提總RNA溶于DEPC水中，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行 PCR。引物由大連寶生物公司合成 (表1)。PCR 參數(shù)：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.9 成脂細(xì)胞鑒定

油紅-O染色：誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞，室溫下用10%福爾馬林固定20 min，加入油紅-O染色20 min。相差顯微鏡下檢測(cè)成脂分化結(jié)果。

PCR鑒定PPARγ2的表達(dá)：目的基因引物序列見表1 (其余同上，PCR鑒定Osteocalcin的表達(dá))。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

牛ADSCs 接種后4~6 h開始貼壁，初為小圓形，細(xì)胞大小不均勻，有部分單核細(xì)胞存在。48 h后逐漸伸展為短梭形、多角形和長(zhǎng)梭形，細(xì)胞折光度較好，4 d后形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣 (圖1)，8~10 d達(dá)到80%~85%匯合。傳代后牛ADSCs呈典型成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng) (圖2)。

2.2 牛ADSCs鑒定

FITC熒光信號(hào)呈綠色，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，在波長(zhǎng) 530 nm以上觀察。第 5代牛 ADSCs細(xì)胞Vimentin、CD49d和CD13均勻染色呈陽性，CD34呈陰性。以PBS代替一抗和牛成纖維細(xì)胞為陰性對(duì)照，以上抗體染色均呈陰性 (圖3)。

圖1 原代牛ADSCs形態(tài)觀察 (100×)Fig. 1 Morphology of primary bovine ADSCs (100×).

圖2 第5代牛ADSCs形態(tài)觀察 (100×)Fig. 2 Morphology of P5 bovine ADSCs (100×).

圖3 牛ADSCs免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig. 3 Results of ADSCs immunofluoresence staining. (A-D) Bovine ADSCs. (E-H) Bovine fibroblasts. (A, E) Vimentin staining. (B, F) CD49 staining. (C, G) CD13 staining. (D, H) CD34 staining. (A1-H1) A-H corresponding to excited without excitation of the original map.

2.3 生長(zhǎng)曲線

從圖4中可以看出，第5、10代的牛ADSCs生長(zhǎng)曲線基本符合細(xì)胞生長(zhǎng)曲線規(guī)律，經(jīng)歷了潛伏期、對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期，分別為1 d、2~6 d、6~8 d后。說明牛ADSCs在體外增殖穩(wěn)定，生長(zhǎng)狀態(tài)無異常。

圖4 牛ADSCs生長(zhǎng)曲線Fig. 4 Growth curve of bovine ADSCs.

2.4 染色體分析

經(jīng)消化收取細(xì)胞進(jìn)行染色體分析，第 5代牛ADSCs有90% (27/30) 細(xì)胞的染色體具有正常二倍體倍性 (圖 5)，第 10代牛 ADSCs有 84% (25/30) 細(xì)胞的染色體仍具有正常二倍體倍性 (圖6)，說明牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在體外生長(zhǎng)染色體正常 (圖5)。

2.5 誘導(dǎo)分化

2.5.1 成骨誘導(dǎo)分化

牛ADSCs成骨誘導(dǎo)后，第10~14天已具有較強(qiáng)成骨活性，21 d后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，骨化結(jié)形成明顯。經(jīng)茜素紅染色呈暗紅色 (圖 7A箭頭所指處)，對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)過21 d培養(yǎng)后仍然呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，細(xì)胞無堆積現(xiàn)象出現(xiàn)，茜素紅染色后無暗紅色骨化結(jié)出現(xiàn) (圖7B)，ALP染色實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈陽性，細(xì)胞著色程度不一，呈藍(lán)紫色，且細(xì)胞密集處著色更深 (圖8A箭頭所指處)，ALP陽性率可到85%以上說明有大量成骨細(xì)胞形成，而對(duì)照組細(xì)胞經(jīng)ALP染色后細(xì)胞無明顯著色，呈陰性 (圖8B)。骨鈣素是骨組織的特異性蛋白，是骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，在牛ADSCs中不表達(dá) (如圖9A中泳道3所示)，在成骨細(xì)胞中表達(dá) (如圖9B中泳道3所示)。以上結(jié)果均說明牛間充質(zhì)干細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)體系下已經(jīng)向成骨細(xì)胞分化。

圖5 F5ADSCs染色體 (1 000×)Fig. 5 Chromosomes of F5ADSCs (1 000×).

圖6 F10ADSCs染色體 (800×)Fig. 6 Chromosomes of F10ADSCs (800×).

圖7 牛ADSCs成骨誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色 (100×)Fig. 7 Alizarin Red Staining of bovine ADSCs after osteogenic induction on 21th day (100×). (A) Experimental group. (B) Control group.

圖8 牛ADSCs成骨誘導(dǎo)21 d后堿性磷酸酶染色 (100×)Fig. 8 ALP Staining of bovine ADSCs after osteogenic induction on 21th day (100×). (A) Experimental group. (B) Control group.

圖9 牛ADSCs電泳結(jié)果Fig. 9 Electrophoresis of bovine ADSCs. (A) Electrophoresis of GAPDH. (B) Electrophoresis of osteoblasts. (C) Electrophoresis of adipocyte. 1: 200 bp marker (TaKaRa); 2: GAPDH (360 bp); 3: Osteocalcin (424 bp); 4: PPARγ2 (564 bp); 5: negative control.

2.5.2 成脂誘導(dǎo)分化

牛ADSCs成脂誘導(dǎo)后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周圍分泌出多邊形、梭形微小油滴，小油滴可慢慢聚合變大，經(jīng)油紅-O染色后呈紅色 (圖10A箭頭所指處)，而細(xì)胞并不會(huì)被著色，對(duì)照組細(xì)胞21 d后細(xì)胞形態(tài)無異常表現(xiàn)，周圍無油滴出現(xiàn)，細(xì)胞沒有向脂肪細(xì)胞分化的跡象，經(jīng)油紅-O染色后無顯色反應(yīng)出現(xiàn) (圖10B)。過氧化物酶體增殖物激活受體 (PPARγ2)與胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞分化和肥胖有密切關(guān)系。PPARγ2是前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯蓄積的重要調(diào)節(jié)因子，在牛 ADSCs中不表達(dá)(如圖9A中泳道4所示)，而在脂肪細(xì)胞中表達(dá) (如圖9C中泳4道所示)，以上結(jié)果均說明牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)體系下已經(jīng)向脂肪細(xì)胞分化。

圖10 牛ADSCs成脂誘導(dǎo)21 d后油紅-O染色 (100×)Fig. 10 Oil Red-O Staining of bovine ADSCsafter adipogenesis introduction on 21th day (100×). (A) Experimental group. (B) Control group.

3 討論

自體脂肪組織因具有來源豐富、取材安全、無免疫排斥反應(yīng)的特點(diǎn)，成為21世紀(jì)理想的軟組織填充材料。但是，多年來移植脂肪組織顆粒仍存在高吸收率和低存活率的問題，至今仍無突破性進(jìn)展。自2001年Zuk等[3]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中含有可分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能的細(xì)胞，被稱為ADSCs。人們分別從人[4-6]、小鼠[7]、大鼠[8]、兔[9]和豬[10]等動(dòng)物體內(nèi)分離得到類似的ADSCs。目前對(duì)于牛、羊等家畜動(dòng)物的相關(guān)研究涉及很少，本研究分離得到的牛 ADSCs與其他物種的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn)相似，同樣具有多向分化潛能。

為了排除紅細(xì)胞的干擾，人們常使用 NH4Cl裂解紅細(xì)胞。鑒于紅細(xì)胞不貼壁的特性，本研究中通過二次換液去除紅細(xì)胞，效果明顯且與使用 NH4Cl裂解紅細(xì)胞并無明顯差異，同時(shí)簡(jiǎn)略了細(xì)胞分離培養(yǎng)步驟，減少細(xì)胞在外界的操作時(shí)間。眾所周知，ADSCs目前尚無特異的表面標(biāo)記，本研究測(cè)定了Vimentin、CD49d、CD13和CD34四個(gè)因子。Vimentin是 5種主要的中間絲之一，存在于各種正常和病理性間質(zhì)來源的組織，本研究中牛ADSCs Vimentin染色呈陽性，說明所分離得到的牛ADSCs是來源于中胚層的干細(xì)胞。CD49d是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞定居歸巢到骨髓的表面分子，CD49d和CD106是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的很好的區(qū)分標(biāo)記[11-12]。CD34是造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記在淋巴結(jié)、骨髓造血干細(xì)胞和各種內(nèi)皮中表達(dá)，CD34陰性說明牛 ADSCs 并非來源于血液循環(huán)中的干細(xì)胞，同時(shí)說明牛 ADSCs 未受到脂肪組織中微血管內(nèi)皮細(xì)胞的污染。以上結(jié)論說明已經(jīng)得到純度較高的牛ADSCs。本研究所用的細(xì)胞表面分子的檢測(cè)可用于鑒定牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。但最好的方法是進(jìn)行多向誘導(dǎo)，并進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)以確定誘導(dǎo)成功。

細(xì)胞基質(zhì)中鈣鹽沉積情況最直接反映了細(xì)胞成骨的程度，茜素紅具因其具有有羥基蒽醌結(jié)構(gòu)，與鈣鹽中的鈣離子結(jié)合后形成配合物顯示為紅色[13-14]，是用于測(cè)定細(xì)胞基質(zhì)中鈣鹽沉積的一種較特異和常用的方法。ALP是成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，在體外鈣化中起關(guān)鍵性作用。目前認(rèn)為，ALP能夠水解有機(jī)磷酸酯，使局部 PO43?濃度升高，并可破壞鈣化抑制劑，從而啟動(dòng)鈣化。ALP活性越高，說明牛ADSCs向成熟成骨細(xì)胞分化越明顯，隨著ALP活性的提高，鈣鹽沉積在膠原纖維上，形成骨化結(jié)。成骨細(xì)胞特異表達(dá)基因骨鈣素在牛 ADSCs和成骨細(xì)胞的差異表達(dá)，在分子水平上說明牛 ADSCs已發(fā)生成骨分化。Hattori等[15]用β-磷酸三鈣復(fù)合體作為經(jīng)向成骨誘導(dǎo)的ADSCs的支架放至裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)有骨組織形成，提示 ADSCs 在脂肪組織工程中有廣闊的應(yīng)用前景。Hong 等[16]用凝膠海綿作支架在體外進(jìn)行人ADSCs成脂分化的三維培養(yǎng)，并用油紅-O染色法進(jìn)行鑒定，經(jīng)過短期培養(yǎng)后與凝膠海綿一起移植至免疫耗竭的小鼠背部，4周后用生物化學(xué)和免疫組織化學(xué)的方法證實(shí)移植物轉(zhuǎn)變?yōu)橹窘M織，認(rèn)為人 ADSCs結(jié)合生物相容并與可降解的凝膠海綿進(jìn)行脂肪組織工程是可行的。本研究中油紅-O染色及PCR結(jié)果同樣證實(shí)牛ADSCs可分化為脂肪細(xì)胞。那么，本研究中牛ADSCs在體外可以分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，是否在動(dòng)物體內(nèi)具有同樣的作用，還需要進(jìn)一步證實(shí)。

本研究培養(yǎng)的牛ADSCs在體外培養(yǎng)取材容易，對(duì)機(jī)體損傷小，分離方法簡(jiǎn)便，體外生長(zhǎng)增殖能力強(qiáng)，經(jīng)多次傳代后細(xì)胞仍生長(zhǎng)穩(wěn)定、增殖速度快、貼壁率高，并且可以定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，填補(bǔ)了ADSCs在牛羊等家畜動(dòng)物研究方面的空缺，因此有望成為脂肪組織工程和基因治療的一種很好的細(xì)胞來源。

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Isolation, cultivation and identification of adipose-derived stem cell in bovines

Yu Ren1, Haiqing Wu1, Yuzhen Ma1,2, Ming Cang1, Rui Wang1, and Dongjun Liu1
1 Key Laboratory of Ministry of Education of China for Mammal Reproduction Biology and Biotechnology, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China
2 Inner Mongolia Hospital, Hohhot 010017, China

To obtain bovine adipose-derived stem cells (ADSCs), bovine ADSCs were digested in collagenase type I solution. The growth curve of ADSCs was checked by cell counting. Chromosome analysis was checked. The molecular markers of ADSCs were detected with immunofluoresence staining. The morphology of ADSCs was identical to fibroblast 1ike and the cells showed active proliferative ability. Vimentin, CD49d and CD13 antigens were detected, but CD34 antigen was negative. Alkaline phosphatase activity was greater in ADSCs during calcification, and Alizarin Red staining was positive. Lipid droplets were apparent around cells during adipogenesis, and Oil Red-O staining was positive. The results demonstrated that ADSCs could be used as seed cells for tissue engineering due to the simple isolation, differentiation and stable and active growth.

adipose-derived stem cell, cell separation in vitro, cell identification, cell differentiation

近年來，因其具有較強(qiáng)自我增殖能力和多向分化潛能的特點(diǎn)，間充質(zhì)干細(xì)胞 (Mesenchymal stem cells，MSCs) 越來越多地受到人們的關(guān)注。現(xiàn)有研究顯示[1]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (Bone marrow stromalstem cells，BMSCs) 可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和成肌細(xì)胞等，這些細(xì)胞有望成為將來組織工程的種子細(xì)胞并為再生醫(yī)學(xué)作出貢獻(xiàn)。然而，傳統(tǒng)獲取骨髓的方法會(huì)給骨髓捐獻(xiàn)者帶來很大的痛苦，同時(shí)，通過這種方法得到的BMSCs數(shù)量有限、價(jià)格昂貴而且易造成細(xì)胞污染[2]，這些成為組織工程進(jìn)一步研究的瓶頸。那么，如何才能解決這一問題？目前大量的目光投向脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived stem cell，ADSCs)，此類細(xì)胞利用簡(jiǎn)單的細(xì)胞消化法即可獲得，而且取材方便，分離得到的ADSCs數(shù)量可觀，體外增殖穩(wěn)定。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，它不僅具有相似的表面抗原標(biāo)記和分化潛能，而且在特定的誘導(dǎo)條件下，同樣可以向 3個(gè)胚層的細(xì)胞分化。但目前脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在牛羊等家畜動(dòng)物中少有研究。牛作為我國(guó)主要的畜產(chǎn)品動(dòng)物來源在畜牧業(yè)中占有重要地位，對(duì)牛的育種改良一直是科研人員工作的重點(diǎn)。目前體細(xì)胞克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)已顯示出在牛的育種改良中具有廣闊的應(yīng)用前景，那么供體細(xì)胞的選擇是否可以提高核移植的成功率以及轉(zhuǎn)基因效率已成為相關(guān)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)課題，牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞以其多能性是否比牛成纖維細(xì)胞更適合作為供體細(xì)胞，從而提高克隆和轉(zhuǎn)基因效率是目前的一個(gè)研究方向。同時(shí)通過建立牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞系也可以為牛的一些地方病的治療提供研究基礎(chǔ)。本研究體外分離培養(yǎng)牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行定向誘導(dǎo)，建立牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞系，為組織工程種子細(xì)胞篩選奠定基礎(chǔ)。

July 7, 2010; Accepted: October 13, 2010

Supported by:Major Projects in Inner Mongolia Natural Science Foundation (No. 20090505).

Yuzhen Ma. Tel/Fax: +86-471-6619236; E-mail: mayz@imnu.edu.cn

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目 (No. 20090505) 資助。