姜媛媛，劉銘瑤，任桂萍，朱慧萌，李德山

東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 生物制藥教研室，哈爾濱 150030

在大腸桿菌中表達重組蛋白具有使用安全、操作簡便、周期短且不存在病毒致癌基因污染等優(yōu)點，是重組蛋白藥物研究和生產(chǎn)中使用最廣泛的表達系統(tǒng)[1-2]。其中關鍵的問題是選用合適的表達載體，現(xiàn)已建立的大腸桿菌表達系統(tǒng)有融合表達、非融合表達、分泌表達、帶純化標簽的表達載體等，而融合表達載體又有pET系列、pTYB及pGEX等。表達載體的類型雖多，但選擇合適的、滿足人們需求的表達載體卻很難，如pET系列載體雖然應用較廣泛，但對有些蛋白的表達卻不是很理想。而其他一些融合蛋白表達系統(tǒng)蛋白表達量雖然很高，但多數(shù)表達的目的蛋白可溶性較差。這就要求尋找更多的高效穩(wěn)定、可溶性較好的表達系統(tǒng)以滿足不同類型基因的表達。

本研究室在表達鼠源成纖維細胞生長因子(FGF)-21的過程中，發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中難以獲得高效穩(wěn)定的可溶性表達，其原因可能在于該蛋白在大腸桿菌中較易被蛋白酶降解。曾嘗試了很多表達載體表達效果均不理想，如 pET系列表達載體、pTYB-11等表達系統(tǒng)對以上蛋白的表達量極低或者幾乎不表達，pGEX6p-1雖然表達量較高，但可溶性目的蛋白所占比例較小。

SUMO (Small ubiquitin-like modifier-1) 是一種小分子泛素樣修飾蛋白，廣泛存在于各種真核細胞中，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白的核質(zhì)運輸以及細胞周期等多種生理進程[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SUMO可以作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、顯著增加重組蛋白表達量以及促進靶蛋白正確折疊、提高可溶性等功能[4]。小分子泛素樣修飾蛋白 (SUMO) 和泛素 (Ub) 在一級結構上只有18%的同源性，然而，兩者的三級結構及其生物學功能卻十分相似[5]，研究表明其作為重組蛋白的融合標簽可以增加蛋白的穩(wěn)定性。

本實驗室自構建了SUMO蛋白融合表達系統(tǒng)，并獲得了鼠源 FGF-21 (mFGF-21) 和多種重組蛋白的高效可溶性表達。該融合表達系統(tǒng)可根據(jù)自身實驗需要設計引物，采用兩種不同切割方式來獲得所需的成熟目的蛋白。一種方式是利用SUMO蛋白酶I切割，經(jīng)SUMO蛋白酶I切割表達的融合蛋白可以獲得純度較高的成熟蛋白且不殘留任何氨基酸殘基，而且SUMO蛋白酶I的識別序列為SUMO蛋白的三級結構。但目前SUMO蛋白酶I在國內(nèi)購買比較困難，而從國外郵購價格比較昂貴 (1000 U約4000元人民幣)。因此，本實驗又設計了另外一種切割方式，即在SUMO融合表達系統(tǒng)中位于SUMO蛋白酶切位點之后引入了羥胺切割位點，利用化學切割方法獲得成熟目的蛋白，這樣可以大大降低蛋白純化的成本，且切割后只殘留一個小分子甘氨酸對蛋白活性并無影響?，F(xiàn)以mFGF-21為例，介紹SUMO蛋白融合表達系統(tǒng)的構建及應用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和受體菌

質(zhì)粒pMD18-T-mFGF-21 (pMD18-T購自TaKaRa公司)、pMD18-T-His-SUMO (pMD18-T購自TaKaRa公司)、受體菌E. coli DH5α菌株、BL21菌株 (含DE3)、Rosetta菌株 (含 DE3)、pET-30a(+)載體由本實驗室提供；小鼠成纖維細胞系3T3-L1購自ATCC。

1.1.2 酶和主要生化試劑

Bsa ?、BamH ?購自New England BioLabs公司；pMD18-T、dNTPs、其他限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；SUMO蛋白酶I購自Life Sensors公司；IPTG (異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、溶菌酶、卡那霉素購自TaKaRa公司；DNA回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；Ni-NTA瓊脂糖顆粒購自QIAGEN公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自 Invitrogen Corporation；新生牛血清 (NCS)、優(yōu)質(zhì)胎牛血清 (FBS) 購自 Invitrogen Corporation；dexamethasone (Dex)、isobutyl methylxanthine (IBMX)、human recombinant insulin購自Sigma公司；葡萄糖檢測試劑盒購自四川邁克科技有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

依據(jù)軟件分析得到的成熟mFGF-21 cDNA序列設計引物P1、P2、P3，將成熟mFGF-21和HisSUMO基因片段與pET-30a(+) 載體連接。引物P1中含有Bsa I和Asc I酶切位點，并且在Asc I酶切位點之后加入羥胺切割位點，P2是從TAA開始3′端編碼區(qū)內(nèi)的序列，其中設計QQQQQC有BamH I酶切位點，使得 PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切后的粘性末端可以與pET-30a(+) 載體相連。P3中含有Bsa I酶切位點，在此位點之后為SUMO蛋白酶I切割位點。構建后的載體根據(jù)需要分別用于表達兩種融合蛋白：一種表達可用于SUMO蛋白酶I切割的融合蛋白 (以P3、P2為引物)；另一種表達帶有羥胺切割位點的融合蛋白 (以 P1、P2為引物)。另外，設計引物 P4、P5，P4含有Nde I酶切位點，P5含有Xho I酶切位點，P4、P5為引物得到的 PCR產(chǎn)物雙酶切后連接至pET-30a(+) 表達載體。引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.2 融合蛋白表達系統(tǒng)的構建

pMD18-T-His-SUMO質(zhì)粒和 pET-30a(+) 分別用Nde I和BamH ?雙酶切，回收酶切片段；將以上兩種回收產(chǎn)物利用T4 DNA連接酶進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定陽性克隆即可獲得 HisSUMO Express表達載體。

以質(zhì)粒 pMD18-T-mFGF-21[6]為模板，分別以P1、P2 (獲得的融合蛋白用于羥胺切割) 和P3、P2 (獲得的融合蛋白用于 SUMO蛋白酶 I切割) 為引物，用rTaq酶進行PCR擴增，反應體系為50 μL。擴增產(chǎn)物分別用Bsa I和BamH ?雙酶切，回收酶切片段；將HisSUMO Express表達載體分別用Bsa I和BamH ?雙酶切，回收酶切載體片段，將酶切回收后的兩種 mFGF-21 PCR產(chǎn)物分別與 HisSUMO Express載體回收產(chǎn)物利用 T4 DNA連接酶進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，分別提取兩種重組質(zhì)粒，Xba I和BamH ?雙酶切鑒定陽性克隆，并將兩種陽性克隆進行測序。

pET30a(+) 載體和質(zhì)粒 pMD18-T-mFGF-21分別用Nde I、Xho I雙酶切，回收酶切片段，制備帶有相匹配粘性末端的線性DNA。將膠回收后的目的片段 mFGF-21與原核表達載體 pET30a(+) 用 T4 DNA連接酶進行連接。連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 BL21感受態(tài)菌中，提取重組質(zhì)粒后分別用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Xho I進行雙酶切鑒定和重組質(zhì)粒的PCR鑒定。陽性重組質(zhì)粒命名為pET-30a(+)-mFGF-21。

1.2.3 目的基因在大腸桿菌中的表達及融合蛋白的純化

將含有正確序列的重組質(zhì)粒 HisSUMO ExpressmFGF-21 (無羥胺切割位點)、重組質(zhì)粒 HisSUMO Economic-mFGF-21 (含有羥胺切割位點) 和重組質(zhì)粒 pET-30a(+)-mFGF-21分別轉(zhuǎn)化至表達菌株Rosetta。轉(zhuǎn)化后的單菌落分別接種至5 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10 h，以1:100接種于500 mL含卡那霉素 (50 mg/mL) 的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 h，A600=0.3~0.6時，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L進行誘導，誘導 3 h后分別取少量菌體及未誘導的對照樣品進行12% SDS-PAGE[7]電泳，并確定表達的目的蛋白占菌體總蛋白的百分比。其余收獲的菌體進行超聲破碎后離心[8]，分別取上清和沉淀進行12% SDS-PAGE電泳分析。菌體經(jīng)超聲破碎后離心，上清經(jīng)Ni-NTA柱親和層析，用雜蛋白洗脫液 (30 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)洗去雜蛋白后，用洗脫液 (250 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0) 洗脫融合蛋白，收集洗脫的第一、二峰。分別取兩種融合蛋白各5 μL進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 融合蛋白的切割

將用于羥胺切割的融合蛋白 (濃度為1 mg/mL)濃縮5倍，分別以體積比為1:1、1:2、1:3、1:4加入2×羥胺切割液[9](2.0 mol/L鹽酸羥胺，0.2 mol/L Ches，在45℃條件下調(diào)節(jié)pH值至9.5)，45℃反應4 h后將各體系加入PBS至蛋白濃縮前體積，取樣進行15% SDS-PAGE檢測，分析最佳羥胺切割液濃度。同時將方法1.2.3收集的SUMO-mFGF-21融合蛋白 (濃度為1 mg/mL) 經(jīng)PBS透析24 h后，以每10 μg融合蛋白: 1U SUMO蛋白酶 I的比例加入SUMO蛋白酶I[10]，DTT終濃度為2 mmol/L，4℃切割過夜，并取樣進行15% SDS-PAGE檢測。

1.2.5 成熟蛋白的純化

羥胺切割后產(chǎn)物經(jīng) PBS緩沖液透析以除去切割液，再經(jīng)Ni-NTA顆粒親和層析，收集唯一的洗脫峰，即為mFGF-21成熟目的蛋白，用洗脫液 (250 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)洗脫 Ni-NTA顆粒結合的小泛素相關修飾物蛋白，15% SDS-PAGE電泳檢測。將SUMO蛋白酶切割后的產(chǎn)物也通過Ni-NTA顆粒親和層析進行純化，具體純化方法同上。經(jīng) HPLC檢測蛋白純度，純度大于95%的目的蛋白用于后續(xù)實驗。

1.2.6 鼠源 FGF-21的免疫活性檢測

本實驗一抗為實驗室自制兔抗人FGF-21抗體，HRP標記的二抗為鼠抗兔抗體，購自 R&D公司。將上述步驟1.2.5中所得的mFGF-21成熟蛋白、小泛素相關修飾物及 BSA對照樣品進行 Western blotting分析。首先將樣品進行15% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%的脫脂奶粉封閉，然后將膜用相應一抗4℃孵育過夜約12 h，二抗室溫孵育2 h后，洗滌，加入化學發(fā)光底物SuperSignal檢測試劑 (PIERCE)，暗室X光片暗匣曝光、顯影。

1.2.7 3T3-L1脂肪細胞的分化

3T3-L1小鼠成纖維細胞以 2.5×104的密度接種細胞于 12孔板中，在含 10%新生小牛血清 NCS (Invitrogen Corporation) 的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細胞長至接觸抑制時，用含10%胎牛血清FBS、0.25 μmol/L地塞米松(Dex)、0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、5 μg/mL重組人胰島素的DMEM培養(yǎng)基分化48 h后，撤去Dex、IBMX，用重組人胰島素再繼續(xù)分化48 h，此后用含10% FBS的DMEM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d，每兩天換一次液直到細胞完成分化，90%以上的細胞表現(xiàn)出脂肪細胞特征。

1.2.8 FGF-21對3T3-L1脂肪細胞糖代謝作用的測定

將分化成熟的 3T3-L1脂肪細胞饑餓處理 12 h后，用不同濃度的成熟mFGF-21蛋白刺激細胞，溫育24 h后，取上清培養(yǎng)基利用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中的葡萄糖含量[11]。同時設未經(jīng)mFGF-21處理的細胞對照組，以未接種細胞空白復孔的糖含量均值相減，算出各孔細胞的葡萄糖消耗量。

每個濃度至少設 3個獨立的重復組，并運用統(tǒng)計學分析實驗結果。數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組間計量資料比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物鑒定

以質(zhì)粒pMD18-T-mFGF-21為模板，分別以P1、P2和P3、P2為引物進行PCR擴增，產(chǎn)物為600 bp左右，與預期大小相符 (圖1)。

2.2 融合表達載體的構建

將膠回收的mFGF-21基因序列和帶有羥胺切割位點的 mFGF-21序列分別與線性化的 HisSUMO Express表達載體連接。重組表達載體經(jīng) Xba I和BamH ?雙酶切鑒定后，分別獲得產(chǎn)物為 912 bp (SUMO序列/目的序列) 和926 bp (SUMO序列/羥胺切割位點/目的序列) 的清晰條帶，與預期一致 (圖2)。 DNA測序結果表明該重組載體中HisSUMO序列以正確的讀碼框插入至 T7啟動子下游，目的片段mFGF-21和帶有羥胺切割位點的mFGF-21序列均以正確的讀碼框插入至 SUMO序列下游。HisSUMO Express和HisSUMO Economic表達載體的構建如圖3所示。

圖1 鼠源FGF-21基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplication of the mouse FGF-21. 1: PCR products with the primer P1 and P2; 2: PCR products with the primer P3 and P2; M: 100 bp DNA ladder.

圖2 重組表達質(zhì)粒 HisSUMO Express-mFGF-21和HisSUMO Economic-mFGF-21的酶切鑒定Fig. 2 Restriction enzyme identification of the recombinant plasmid HisSUMO Express-mFGF-21 and HisSUMO Economic-mFGF-21. 1: HisSUMO Express-mFGF-21/Xba I+BamH ? (without hydroxylamine cleavage site); 2: HisSUMO Express-mFGF-21 (without hydroxylamine cleavage site); 3: DNA marker DL15000; 4: recombinant plasmid HisSUMO Economic-mFGF-21/Xba I+BamH ? (containing hydroxylamine cleavage site); 5: recombinant plasmid HisSUMO EconomicmFGF-21 (containing hydroxylamine cleavage site).

取陽性重組質(zhì)粒 pET-30a-mFGF-21，分別用限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I進行雙酶切鑒定和重組質(zhì)粒的PCR鑒定。用限制性內(nèi)切酶Nde I、Xho I進行雙酶切，獲得兩個片段，分別為約 5300 bp的pET-30a(+) 載體片段和約550 bp的mFGF-21目的基因片段。以P4和P5為引物、pET-30a-mFGF-21為模板進行PCR鑒定，在約550 bp處有一條目的帶，與預期插入片段大小 (561 bp) 相符 (圖4)，確認陽性重組質(zhì)粒pET-30a-mFGF-21構建成功 (圖5)。

圖3 表達載體HisSUMO Express和HisSUMO Economic構建圖譜Fig. 3 Constructinon of HisSUMO Expression and HisSUMO Economic.

2.3 SUMO-mFGF-21融合蛋白的表達及純化

將含有重組質(zhì)粒 HisSUMO Express-mFGF-21 (無羥胺切割位點)、重組質(zhì)粒 HisSUMO EconomicmFGF-21 (含有羥胺切割位點)、pET-30a(+) -mFGF-21的 Rosetta菌株接種后誘導，加入 IPTG誘導3 h后取樣進行電泳分析，結果顯示pET-30a(+)系統(tǒng)未能表達mFGF-21，而融合蛋白在SUMO體系中表達量較高，且均為可溶性蛋白 (圖 6)，純化后的SUMO-mFGF-21融合蛋白上樣量為5 μL (濃度約為1 mg/mL)，其分子量約為44 000 Da (圖7)。融合蛋白經(jīng)蛋白薄層掃描計算融合蛋白的表達量，如圖8所示，可見經(jīng)HisSUMO Express系統(tǒng)表達mFGF-21重組蛋白占宿主細胞中總蛋白質(zhì)的 40%，而HisSUMO Economic系統(tǒng)表達的mFGF-21重組蛋白占宿主細胞中總蛋白質(zhì)的43.17%。

圖4 重組質(zhì)粒pET-30a-mFGF-21的酶切鑒定Fig. 4 Identification of recombinant plasmid pET-30a-mFGF-21 by enzyme digestion. 1: DNA marker DL2000; 2: 1 kb Plus DNA ladder; 3: recombinant plasmid pET-30a-mFGF-21 digested with Nde I and Xho I.

圖5 重組質(zhì)粒pET-30a-mFGF-21的PCR鑒定Fig. 5 Identification of the positive plasmid of pET-30a-mFGF-21 by PCR. 1: 100 bp DNA marker; 2: PCR products with the primer P4 and P5.

2.4 融合蛋白的切割情況分析

融合蛋白經(jīng)不同濃度羥胺切割液切割，并與蛋白酶切割作對比。蛋白 (1 mg/mL) 與羥胺切割液體積比為1:4時蛋白切割效率較高，結果如圖9所示。而蛋白酶價格昂貴，鹽酸羥胺則比較經(jīng)濟，可以通過提高羥胺濃度來提高切割效果。

圖6 HisSUMO Express和HisSUMO Economic表達載體介導的鼠源FGF-21蛋白的表達Fig. 6 Expression of mFGF-21 in E. coli mediated by HisSUMO Express and HisSUMO Economic. 1: supernatant of Rosetta cells harboring HisSUMO Express-mFGF-21 (without hydroxylamine cleavage site) 3 hours after IPTG induction; 2: precipitate of Rosetta cells harboring HisSUMO ExpressmFGF-21 without IPTG induction (without hydroxylamine cleavage site); 3: supernatant of Rosetta cells harboring HisSUMO Economic-mFGF-21 3 hours after IPTG induction (containing hydroxylamine cleavage site); 4: precipitate of Rosetta cells Harboring HisSUMO Economic-mFGF-21 without IPTG induction (containing hydroxylamine cleavage site); 5: protein molecular mass marker; 6: Rosetta cells harboring HisSUMO Economic-mFGF-21 expression vector (containing hydroxylamine cleavage site) without IPTG induction; 7: lysates of Rosetta cells harboring recombinate pET-30a(+)-mFGF-21 expression vector 3 hours after IPTG induction; 8: lysates of Rosetta cells harboring recombinate pET-30a(+)-mFGF-21 expression vector without IPTG induction.

圖7 SUMO-mFGF-21的純化Fig. 7 Purification of SUMO-mFGF-21. 1: SUMO-mFGF-21 protein (without hydroxylamine cleavage site); 2: protein marker; 3: SUMO-mFGF-21 protein (containing hydroxylamine cleavage site).

圖8 誘導菌總蛋白、His-SUMO-FGF-21重組蛋白的薄層掃描圖Fig. 8 Laminal scanning figure of protein content of the positive bacterium.

圖9 SUMO-mFGF-21融合蛋白經(jīng)羥胺切割后的SDS-PAGE電泳分析Fig. 9 SDS-PAGE analysis of SUMO-mFGF-21 fusion protein after cleaved by hydroxylamine. 1: SUMO-mFGF-21 protein before cleavage (without hydroxylamine cleavage site); 2: SUMO-mFGF-21 protein before cleavage (containing hydroxylamine cleavage site); 3: protein marker; 4: the products of SUMO-mFGF-21 fusion protein after cleaved by SUMO protease I (without hydroxylamine cleavage site); 5: the products cleaved by hydroxylamine with the radio of the fusion protein and hydroxylamine solution is 1:4; 6: the products cleaved by hydroxylamine with the radio of the fusion protein and hydroxylamine solution is 1:3; 7: the products cleaved by hydroxylamine with the radio of the fusion protein and hydroxylamine solution is 1:2; 8: the products cleaved by hydroxylamine with the radio of the fusion protein and hydroxylamine solution is 1:1.

2.5 成熟蛋白純化產(chǎn)物

將 SUMO融合蛋白經(jīng)羥胺切割后的產(chǎn)物置于PBS緩沖液中透析24 h，再經(jīng)Ni-NTA顆粒親和層析，收集唯一的洗脫峰，即為mFGF-21成熟蛋白，15% SDS-PAGE電泳檢測 (圖10)。純化的mFGF-21成熟蛋白回收量約為54 mg/L，成熟蛋白回收率約為6%。

2.6 mFGF-21的免疫活性檢測分析

通過軟件比對鼠源FGF-21與人源FGF-21的氨基酸序列可知兩者的同源性達80.66%，表明兔抗人全長FGF-21抗體可與mFGF-21發(fā)生很強的交叉反應，因此可用兔抗人FGF-21抗體作為1抗檢測mFGF-21。Western blotting試驗中1號泳道加入1 μg BSA作為陰性對照，2號泳道加入1 μg SUMO-mFGF-21融合蛋白 (含羥胺切割位點)，3號泳道加入 10 ng純化的mFGF-21蛋白作為待檢物。Western blotting結果分析表明，2、3號泳道的蛋白與抗人FGF-21抗體發(fā)生反應，該條帶分別為 SUMO-mFGF-21融合蛋白和mFGF-21。證明抗人FGF-21抗體與鼠FGF-21反應的特異性，且所純化的蛋白為成熟 mFGF-21，如圖11所示。

2.7 3T3-L1脂肪細胞的分化

圖10 SDS-PAGE電泳分析純化的成熟鼠源FGF-21Fig. 10 SDS-PAGE analysis of purified mouse FGF-21. 1: protein marker; 2: purified mouse FGF-21; 3: the products of SUMO-mFGF-21 fusion protein after cleaved by hydroxylamine.

圖11 鼠源FGF-21的Western blotting分析Fig. 11 Characterization of the mouse FGF-21 by Western blotting. 1: BSA; 2: SUMO-mouse FGF-21; 3: mouse FGF-21.

小鼠成纖維細胞3T3-L1形成單層后，用脂肪細胞分化液I (5 mg/L 重組人胰島素，0.25 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L IBMX，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基) 誘導分化48 h，再用脂肪細胞分化液II (5 mg/L重組人胰島素，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基) 繼續(xù)誘導48 h，此后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)維持，每兩天換一次液，分化14 d后，分化率可達90%以上的細胞用于葡萄糖吸收試驗，如圖12所示，左圖為未分化的 3T3-L1前脂肪細胞，細胞呈成纖維狀，右圖為分化成熟的脂肪細胞，細胞內(nèi)有大量的脂滴積聚，表現(xiàn)出明顯的脂肪細胞特征。

2.8 鼠FGF-21對脂肪細胞中葡萄糖吸收的影響

用培養(yǎng)基稀釋分別經(jīng)羥胺和SUMO蛋白酶I切割后的成熟mFGF-21，使其終濃度分別為0.1、1、10、100、1000 nmol/L。用以上濃度的mFGF-21處理小鼠3T3-L1脂肪細胞，24 h后取上清培養(yǎng)基經(jīng)微量化的GOD-POD法檢測培養(yǎng)基中葡萄糖含量，統(tǒng)計學分析結果顯示，細胞對葡萄糖的攝取利用顯著增加，與未經(jīng)任何處理的對照組相比，殘存在培養(yǎng)基中的葡萄糖含量明顯減少 (兩樣本比較的t檢驗，P<0.05差異顯著，P<0.001差異極顯著)。未經(jīng)處理的空白對照組中，小鼠3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗率只有44.61%，而經(jīng)mFGF-21 (SUMO蛋白酶I切割) 作用的脂肪細胞葡萄糖消耗率顯著增加，在濃度為 0.1 nmol/L時可達到 50.78%，并且隨著mFGF-21濃度的增加，細胞葡萄糖消耗率顯著增加，呈劑量依賴關系，在濃度為 1000 nmol/L時高達80.66%，比未處理空白對照增加近40%，而羥胺切割后的mFGF-21處理3T3-L1脂肪細胞也能達到相同的結果，處理后的細胞葡萄糖消耗率顯著增加，并呈劑量依賴性關系，如圖13所示?？梢姡瑑煞N切割方式獲得的mFGF-21均具有促進脂肪細胞消耗葡萄糖的生物學功能。

圖12 3T3-L1前體脂肪細胞分化圖 (400×)Fig. 12 Differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes (400×).

圖13 鼠源FGF-21作用后3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的消耗曲線Fig. 13 Glucose uptake of 3T3-L1 adipocytes treated with mouse FGF-21. The values (± SE) shown are the average of at least 3 independent measurements. *P<0.05; **P<0.001 compared with no stimulated control.

3 討論

本實驗室成功構建了 HisSUMO Express和HisSUMO Economic 兩個表達系統(tǒng)，并分別利用這兩種系統(tǒng)成功地表達和純化了 mFGF-21，利用SUMO蛋白酶I或羥胺切割液切割均能獲得具有活性的目的蛋白。由于SUMO蛋白酶I和SUMO蛋白引入了多聚組氨酸，可以與 Ni-NTA瓊脂糖顆粒結合，因此可以利用 Ni-NTA親和層析分離出有活性的成熟蛋白。

先前的大量實驗表明，F(xiàn)GF-21在大腸桿菌中難以獲得高效可溶性表達，最初筆者使用pET系列和pTYB表達系統(tǒng)，但目的蛋白表達量極低。而通過分子伴侶進行融合表達 (如pGEX表達系統(tǒng))，盡管可以提高蛋白的表達量以及成熟蛋白的收獲率，但多數(shù)融合蛋白是以包涵體的形式表達，復性比較困難，在此過程中也摸索了很多誘導條件，但表達效果均不理想 (數(shù)據(jù)未顯示)。

SUMO近年來被發(fā)現(xiàn)可用作分子伴侶來增加外源蛋白的穩(wěn)定性和可溶性，其作用機理可能是SUMO蛋白作為一個高度疏水的核心為目的蛋白的折疊提供成核位點[8-10]，促進蛋白間的相互作用并使其正確折疊，最終增強了融合蛋白的可溶性[10]。誘導時間對于融合蛋白SUMO-mFGF-21的表達量影響較大，誘導3 h、4 h、5 h時蛋白表達量較高，當誘導過夜時融合蛋白含量較少，推測可能被菌體內(nèi)的蛋白酶所降解。為避免純化時雜蛋白含量較高，本實驗選擇了誘導2 h，制備獲得了純度較高的融合蛋白。

本實驗所構建的融合表達載體可根據(jù)需要選擇融合蛋白切割方式，該融合蛋白在利用SUMO蛋白酶I進行切割時可保證無氨基酸殘留，切割后，成熟的mFGF-21有明顯促進3T3-L1脂肪細胞吸收葡萄糖的活性。但SUMO蛋白酶I價格比較昂貴，并且在國內(nèi)購買比較困難。在此基礎上我們又構建了比較經(jīng)濟實用的、用鹽酸羥胺來切割融合蛋白的表達體系，據(jù)資料顯示羥胺切割位點在蛋白中存在較少，經(jīng)軟件分析成熟mFGF-21氨基酸序列內(nèi)無羥胺切割位點。本實驗構建載體時在SUMO和mFGF-21之間加入羥胺切割位點，且通過摸索切割液濃度可以選擇最適合的比例切割，以達到較高的切割效率。羥胺切割后只在氨基端殘留一個小分子甘氨酸，經(jīng)實驗證明并不影響蛋白活性。羥胺切割純化的成熟mFGF-21具有促進脂肪細胞吸收葡萄糖的作用，并呈劑量依賴性。此外，除了mFGF-21以外，本實驗室還利用HisSUMO Express和HisSUMO Economic表達系統(tǒng)成功地表達了人源FGF-21、人源IL-1β[12-14]、IL-17、TNFα等蛋白，所得蛋白均為可溶性，約占宿主細胞總蛋白的40%左右，并且獲得的蛋白均具有生物學活性。由此可見，本實驗所構建的2個表達系統(tǒng)均可以高效表達可溶性目的蛋白，既可用SUMO蛋白酶I切割，又可以通過比較經(jīng)濟的化學切割方法純化成熟蛋白，而且化學切割方法經(jīng)濟可行比較適合我國國情，該載體的構建是蛋白表達純化領域中表達載體的一個重要改進，為生物技術領域中重組蛋白的研究和應用提供了有用的工具。

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