何子純 李升錦

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科 重慶 400010)

結(jié)核分枝桿菌持留生存機制的研究進展

何子純 李升錦

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸科 重慶 400010)

全球約有1/3人口被結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染,但只有10%的感染者可發(fā)生結(jié)核病,而絕大多數(shù)是以潛伏感染形式存在。MTB的潛伏感染決定于MTB能在宿主體內(nèi)以持留狀態(tài)存在的能力。處于持留狀態(tài)的MTB能抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬殺滅作用,并能耐受通常對生長繁殖期的MTB具有殺滅作用的抗結(jié)核藥的殺滅作用[1]。因此,研究MTB進入代謝或休眠持留期和在持留狀態(tài)下存活的機制,進而尋找抑制其進入持留期和殺滅結(jié)核持留菌的方法,對于控制和根除結(jié)核病具有重要的臨床意義。

1 結(jié)核持留菌的研究背景

MTB是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌,并借胞內(nèi)環(huán)境避免暴露于任何細(xì)胞外免疫系統(tǒng)。人們常以M TB在宿主體內(nèi)以非增殖狀態(tài)存在從而造成延緩性病程和導(dǎo)致復(fù)發(fā)的潛伏形式稱為持留現(xiàn)象和持留性,引起這種現(xiàn)象的菌群稱為持留菌。結(jié)核持留菌的存在很早就得到體內(nèi)外實驗的證實,20世紀(jì) 50年代McCune等[2]在 Cornell模型中用大劑量有毒株MTB感染小鼠,并讓疾病進展2周,再用抗結(jié)核藥物治療,后取小鼠的肺和脾臟培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)無MTB生長,停止治療間隔一段時間后MTB又會重新在這些組織出現(xiàn),因此McCune認(rèn)為這些組織中可能存在休眠持留狀態(tài)的M TB[2]。1995年,de Wit等[3]用PCR法在一小鼠休眠結(jié)核病模型中證實,經(jīng)異煙肼和利福平長期化療后培養(yǎng)無菌的組織內(nèi)有MTBDNA的存在,化療停止后臟器培養(yǎng)可復(fù)陽。Wayne等[4]用逐漸降低培養(yǎng)液中氧濃度的方法將MTB誘導(dǎo)進入休眠持留狀態(tài),發(fā)現(xiàn)生長繁殖期MTB和休眠持留期MTB的異檸檬酸水解酶(isocitrate lyase,ICL)、觸酶以及超氧化物歧化酶等的濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義。然而目前仍不清楚是否細(xì)菌的發(fā)育狀態(tài)的改變使得他們不能被免疫系統(tǒng)識別,亦或是可能由于細(xì)菌表面模式的改變使其免疫原性改變而無法被免疫系統(tǒng)識別。隨著分子生物學(xué)研究的快速發(fā)展,對結(jié)核持留菌的認(rèn)識也在不斷深入。

2 MTB持留生存機制

MTB持留生存機制是指MTB依靠自身和宿主的特性以及它們之間的相互作用在宿主體內(nèi)長期存在的方式。該機制會導(dǎo)致結(jié)核菌潛伏感染、內(nèi)燃復(fù)發(fā)、長期治療、結(jié)核菌耐藥性等一系列問題,因此深入研究MTB持留生存機制,查找MTB在宿主體內(nèi)以非增殖狀態(tài)存在的本質(zhì)原因,對于研制抗結(jié)核持留菌藥物有重要的支撐作用。

2.1 MTB代謝改變 M TB從生長繁殖期進入休眠持留期伴隨了某些酶、蛋白質(zhì)等生物學(xué)特性的改變,以適應(yīng)胞內(nèi)低氧缺乏營養(yǎng)的環(huán)境。首先,MTB改變原有的有氧代謝途徑,轉(zhuǎn)向依靠乙醛酸循環(huán)支路獲取能量和碳源同時降低代謝率,維持其在胞內(nèi)長期生存的需要。ICL是乙醛酸代謝途徑的一個關(guān)鍵酶,對M TB的持留性起著決定性的作用。McK-inney等[5]用敲除了icl基因的MTB感染小鼠的實驗證明,敲除株感染小鼠后很快被免疫系統(tǒng)清除,野生株菌負(fù)荷指數(shù)卻一直保持不變,顯示出持留性。其次,Cuuningham等[6]用轉(zhuǎn)換電子顯微鏡和SDSPAGE方法發(fā)現(xiàn)無氧條件下MTB細(xì)胞壁有增厚,且與16 kD的小熱休克蛋白高表達有關(guān),M TB的細(xì)胞壁增厚有助于抵抗藥物進入細(xì)胞內(nèi),這也可能是藥物對MTB殺傷作用較弱的主要原因。細(xì)菌代謝表型的特異性是藥物篩選的重要性狀之一,深入了解控制代謝表達的基因,對尋找治療結(jié)核持留菌感染的藥物靶點有重要的指導(dǎo)作用。

2.2 影響吞噬溶酶體的形成 吞噬體與溶酶體融合形成吞噬溶酶體,是巨噬細(xì)胞抗原提呈和清除入侵病原微生物的重要途徑。最近研究報道[7-8]吞噬體的成熟是一個內(nèi)質(zhì)體與膜蛋白循環(huán)過程,M TB吞噬體卻可以特異地清除某些重要膜蛋白,使吞噬體不能有效成熟而不能與溶酶體融合。酸性微環(huán)境有利于溶酶體酶活性的發(fā)揮,但MTB不僅產(chǎn)生NH+4中和吞噬體的酸化,還能抑制質(zhì)子-ATP酶降低吞噬體的酸化,并使含菌吞噬體與非溶酶體的內(nèi)質(zhì)體結(jié)合而阻礙吞噬溶酶體的形成[9]。Walburger等[10]還研究到敲除MTB的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶G(pknG)基因或利用特異性抑制劑阻斷激酶活性,可有效地促進巨噬細(xì)胞內(nèi)含MTB的吞噬體與溶酶體發(fā)生融合,感染的MTB也很快被巨噬細(xì)胞殺滅。此外,有毒 MTB細(xì)胞壁含量最多的脂質(zhì)物TDM(T rehalose 6,6-dimycolate)可通過減少吞噬體的酸化和阻礙吞噬溶酶體融合[11],吞噬溶酶體形成受阻,溶酶體中的酶就不能進入含菌吞噬體中作用,MTB就得以存活下來。

2.3 影響巨噬細(xì)胞信號傳導(dǎo)的活化 巨噬細(xì)胞受到刺激時能產(chǎn)生使其活化的信號,獲得殺菌活性。γ-干擾素(IFN-γ)是巨噬細(xì)胞活化的主要介質(zhì),MTB感染的巨噬細(xì)胞卻對IFN-γ刺激敏感性大大降低[12]。研究表明[13-14],MTB感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞上調(diào)表達細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子(SCOS)和IL-6參與了這一過程。SCOS通過JAK/STAT信號傳導(dǎo)途徑抑制IFN-γ的功能,并抑制IFN-γ激活的下游基因表達;IL-6則通過某種不依賴信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子l(STAT-1)的途徑抑制IFN-γ激活的下游基因表達,并降低未感染的巨噬細(xì)胞對IFN-γ刺激的敏感性。MTB的細(xì)胞壁大量表達一種含特殊多糖結(jié)構(gòu)的糖基磷酯酰肌醇(GPI)-阿拉伯甘露糖(LAM),LAM能插入巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜上富含GPI的區(qū)域。插入的LAM一方面可改變巨噬細(xì)胞的膜表面標(biāo)記,抑制巨噬細(xì)胞向CD4+T細(xì)胞呈遞抗原的能力,降低CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ;另一方面可改變巨噬細(xì)胞膜上IFN-γ受體結(jié)構(gòu),使巨噬細(xì)胞對IFN-γ刺激的敏感性降低[15]。同時M TB細(xì)胞壁上的一種19X103脂蛋白能以Toll樣受體依賴的機制抑制IFN-γ誘導(dǎo)的下游基因表達,抑制巨噬細(xì)胞的活化[16]。

2.4 逃避ROI和RNI的殺傷作用 巨噬細(xì)胞活化后產(chǎn)生反應(yīng)氧中間產(chǎn)物(ROI)和反應(yīng)氮中間產(chǎn)物(RNI)消滅吞入的病原菌。研究發(fā)現(xiàn)不能產(chǎn)生ROI的D9變異型巨噬細(xì)胞與能正常產(chǎn)生ROI的未變異巨噬細(xì)胞對MTB殺傷活性表現(xiàn)一致。應(yīng)用氧自由基清除劑(如超氧化物歧化酶、觸酶等)處理巨噬細(xì)胞,其殺結(jié)核菌能力也沒有明顯的變化,由此可知MTB對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的ROI有高度的耐受性。耐受機制可能是：MTB胞壁上的相關(guān)糖脂及菌體分泌的糖脂均有高效的氧自由基清除作用,可抑制巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)的殺傷;MTB產(chǎn)生的蛋白過氧化氫酶-過氧化物酶(KatG)具有錳離子依賴的過氧化物酶活性、細(xì)胞色素P450樣的加氧酶活性及過氧亞硝酸酶活性,在MTB抵抗ROI及RNI殺傷中起重要作用;MTB降低巨噬細(xì)胞的細(xì)胞色素C氧化酶的表達,抑制了呼吸爆發(fā),因為此酶是電子傳遞鏈終末環(huán)節(jié)的酶,從而逃避了殺傷[17]。

2.5 降低巨噬細(xì)胞的凋亡率 Balcewicz-Sablinska等分別用減毒株H37Ra和有毒株H37Rv感染巨噬細(xì)胞,并檢測2者誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的差異,發(fā)現(xiàn)前者明顯高于后者。進一步研究發(fā)現(xiàn)H37Rv感染組可溶性TNF-α受體-2(sTNFR-2)的水平明顯升高,且在H37Ra感染組培養(yǎng)液中外源加入sTNFR-2可使該組巨噬細(xì)胞的凋亡水平降至H37Rv感染組相一致的水平。因此可知MTB通過誘導(dǎo)sTNFR-2的表達上調(diào)來抑制巨噬細(xì)胞的凋亡作用[18]。同時H37Rv還能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡抑制因子Mcl-l的表達上調(diào),和/或降低了巨噬細(xì)胞表面Fas的表達水平,減少巨噬細(xì)胞的凋亡[19-20]。另外,M TB胞壁的LAM也可通過 cAMP抑制劑等抑制細(xì)胞發(fā)生凋亡[21]。巨噬細(xì)胞凋亡率的下降保存了持留菌賴以生存的環(huán)境,是MTB持留生存過程中的重要步驟。將提高巨噬細(xì)胞的凋亡率作為殺滅持留菌的一個治療靶標(biāo)具有一定的研究意義。

2.6 MTB持留的基因控制機制研究 MTB基因者組全序列的闡明及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為闡明MTB持留現(xiàn)象的分子機制提供了有效的手段,研究發(fā)現(xiàn)MTB進入巨噬細(xì)胞后存在特殊的基因表達以適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境。至今主要有sigF,Msr,PcaA,PE家族等基因的研究。近期還發(fā)現(xiàn) relA基因可調(diào)控細(xì)菌的緩慢生長,誘導(dǎo)MTB進入休眠持留狀態(tài),Dahl等[22]用實驗作了進一步證明,并了解到relA基因主要調(diào)節(jié)了另2個與持留相關(guān)的hspX基因和eis基因的表達。hspX基因是能夠調(diào)節(jié)MTB進入休眠持留狀態(tài)的DosR蛋白的一個調(diào)節(jié)因子[23]。eis基因由于具有提高MTB在巨噬細(xì)胞中生存能力的作用而且特異性表達于致病的MTB復(fù)合群引起了人們特別關(guān)注[24]。當(dāng)外周血淋巴細(xì)胞受到Eis抗原的刺激時,以Th2型細(xì)胞分泌IL-10的細(xì)胞免疫為主,活動性肺結(jié)核患者對Eis抗原的細(xì)胞免疫水平低下,經(jīng)抗結(jié)核治療康復(fù)后細(xì)胞免疫維持在較高水平[25],而Th2型免疫反應(yīng)則與感染的進展、持續(xù)和慢性化有關(guān)[26]?；蛐酒夹g(shù)為研究生長繁殖期和靜止持留階段MTB的基因表達差異提供了方便,但是確定哪些或者哪一個特定基因從本質(zhì)上調(diào)控了MTB持留性,有待進一步的實驗證實。

3 針對結(jié)核持留菌的治療現(xiàn)況

現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物對持留性MTB的殺傷作用非常弱,這也是抗結(jié)核化療時間較長的主要原因,過長的療程也極易導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生。研發(fā)抗結(jié)核持留菌藥物能明顯縮短治療周期,防止結(jié)核病內(nèi)燃復(fù)發(fā),降低耐藥菌產(chǎn)生機率,具有重要的臨床意義。針對抗結(jié)核持留菌藥物研究大致可從3方面入手：(1)消滅MTB在藥物敏感的增值狀態(tài)阻止其進入持留進程;(2)將MTB持留菌殺死在持留狀態(tài);(3)使其復(fù)活進入藥物敏感狀態(tài)然后消滅它。

甲硝唑是研究較早的1個抗結(jié)核持留菌的藥物,Wayne等[27]利用逐漸降低培養(yǎng)環(huán)境中氧濃度的方法誘導(dǎo)的結(jié)核持留菌模型來檢測一定劑量的異煙肼、利福平、甲硝唑的抗結(jié)核效應(yīng),發(fā)現(xiàn)甲硝唑降低集落刺激單位(CFU)作用最明顯。但是甲硝唑?qū)TB的殺滅作用有一定的限制,故在臨床上應(yīng)用較少[28]。另一藥物硝基咪唑并吡喃類(NAPs)化合物PA-824對低氧環(huán)境下培養(yǎng)的非復(fù)制期結(jié)核分枝桿菌模型有長期的殺菌作用,其活性類似于甲硝唑[29],現(xiàn)已進入臨床試驗階段。

異檸檬酸裂合酶(ICL)是MTB胞內(nèi)厭氧代謝的關(guān)鍵酶,將ICL作為抗結(jié)核持留感染的藥物作用靶點,達到消滅宿主體內(nèi)結(jié)核持留菌的目的,是最近國內(nèi)外研究的一個熱點。體外具有活性的ICL抑制劑溴3-丙酮酸和3-硝基丙酸鹽正在篩選試驗研究中[30],針對該靶點的新的藥物也在積極的研發(fā)。同時國內(nèi)學(xué)者還深入開展中藥的抗結(jié)核研究,詹莉等[31]報道了中藥貓爪草(小毛莨內(nèi)酯)可能通過促進宿主細(xì)胞顆粒裂肽mRNA的表達,增強機體CTL殺菌能力,達到抗結(jié)核持留菌的作用。盡管中藥成分多,作用機制復(fù)雜,但隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展,研發(fā)抗結(jié)核持留性的中藥復(fù)方制劑將有一定的前景。

4 結(jié)語

通過上面的闡述我們可以看出,目前雖然關(guān)于結(jié)核持留方面的研究很多,而這些研究結(jié)果也確實顯示與MTB持留生存相關(guān),但是至今我們還沒有得到最清晰的MTB持留生存的機制,這也是為什么現(xiàn)在還未找到治療結(jié)核菌持留感染的方法的關(guān)鍵所在。MTB能夠在宿主體內(nèi)持留生存或許是由多方面的因素決定的,但是也有可能存在某一關(guān)鍵因素,找到這一關(guān)鍵因素對控制和根除結(jié)核病將是一個重大的突破,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,基因水平的研究將是解決這一難題的一個重要突破口。

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重慶醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項目(XB200512)

李升錦(lsj1025@163.com)

2009-03-30)

(本文編輯：張曉進)