胡宗禮， 黃曉萍， 陳珺霞

(韶關(guān)學(xué)院英東生物工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005)

甘木通(Clematis filamentosa Dunn)為毛莨科鐵線蓮屬植物，用于防治冠心病、高血壓等療效顯著［1］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘木通能顯著改善正常家兔的血液流變學(xué)特性［2］，但對(duì)動(dòng)物高脂血癥的作用尚未見(jiàn)有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用家兔實(shí)驗(yàn)性高脂血癥模型，觀察甘木通乙醇提取物(extract of Clematis filamentosa Dunn，ECFD)對(duì)家兔高脂血癥的預(yù)防作用，為擴(kuò)大甘木通的臨床應(yīng)用范圍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材與試劑

甘木通藥材(由廣東雷霆國(guó)藥有限公司提供，采收于2008年11月);膽固醇(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào):72710150);膽酸鹽(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20070828);TG、TC、HDL－C 和 LDL－C 檢測(cè)試劑盒(湖南永和陽(yáng)光科技有限責(zé)任公司，批號(hào):20090420);分析純無(wú)水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心);豬油、蛋黃、普通飼料等均為市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康大白兔，購(gòu)自廣東省從化市太平信華動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，體重1.5～2.0 kg，♂♀兼用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證［SCXK(粵)2009－0023］。

1.3 主要儀器設(shè)備

OLYMPUS AU－640型全自動(dòng)生化分析儀(日本);TG16－WS型臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司);FW177型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司);RE－52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司);TC－120型智能程控生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)(湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司);珊頓325型石蠟切片機(jī)(英國(guó));OLYMPUS－BX41型正置系統(tǒng)金像顯微鏡(日本);HPIS－2000型病理圖像分析系統(tǒng)(西安華海醫(yī)療信息技術(shù)股份有限公司)。

1.4 受試藥物及飼料的制備

1.4.1 受試藥物的制備

甘木通藥材經(jīng)干燥、粉碎，過(guò)60目篩。以70%乙醇為提取溶劑，藥材與溶劑比例為1:20(W/V)，于90℃條件下加熱回流提取1 h，共提取3次，合并3次濾液，減壓回收乙醇后，進(jìn)一步減壓濃縮至棕褐色膏狀(每1 g相當(dāng)于原藥材5 g)，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 高脂飼料的制備

普通飼經(jīng)料粉碎后，按每100 g高脂飼料含膽固醇1.0 g、蛋黃粉5.0 g、豬油10.0 g、膽酸鹽0.5 g、普通飼料 83.5 g的比例配制，充分混合后，制備成顆粒狀飼料。

1.4.3 含ECFD飼料的制備

普通飼經(jīng)料粉碎后，按每100 g飼料含ECFD 20 g、普通飼料80 g的比例配制，充分混合后制備成顆粒狀飼料。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 模型制備與實(shí)驗(yàn)分組

參照文獻(xiàn)方法［3］，家兔用普通飼料喂養(yǎng)2周后，從耳動(dòng)脈取血測(cè)定血清TC、TG、HDL－C和 LDL－C含量，選擇結(jié)果較一致的家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。32只合格家兔隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、ECFD低劑量預(yù)防組和高劑量預(yù)防組，每組8只，所有家兔均單籠飼養(yǎng)。正常對(duì)照組家兔給予普通飼料喂養(yǎng);模型對(duì)照組家兔每天先給予高脂飼料50 g/kg;ECFD組每天先給予高脂飼料50 g/kg，然后給予含ECFD飼料12.5 g/kg(即ECFD 2.5 g/kg)和含ECFD飼料25 g/kg(即ECFD 5.0 g/kg)。各組飼料不足部分用普通飼料補(bǔ)充，自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)8周，每2周稱量一次家兔體重用于調(diào)整飼料量。

1.5.2 血脂測(cè)定

分別于第4周、第8周末取血按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定各項(xiàng)血脂指標(biāo)，TG的測(cè)定采用酶比色法(GPO－POP法)，TC的測(cè)定采用 COD－CE－PAP 法，HDL－C 與 LDL－C 的測(cè)定采用直接法。

1.5.3 動(dòng)脈硬化指數(shù)(arteriosclerotic index，AI)的計(jì)算［3］422

根據(jù)測(cè)定的血脂結(jié)果計(jì)算AI值，AI=(TC－HDL－C)/HDL－C

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ECFD對(duì)家兔高脂血癥的預(yù)防作用

各組家兔喂養(yǎng)4周或8周時(shí)，模型對(duì)照組家兔血清TC、TG、LDL－C水平與正常對(duì)照組比顯著升高(P＜0.01)，而HDL－C水平僅呈升高趨勢(shì)(P＞0.05)。ECFD低劑量或高劑量給藥組家兔血清TC、TG、LDL－C水平與模型對(duì)照組比有顯著降低(P＜0.01)，血清HDL－C水平與正常對(duì)照組或模型對(duì)照組比均呈明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果提示，ECFD對(duì)家兔高脂血癥的形成具有一定的預(yù)防作用(見(jiàn)表 1、2)。

表1 第4周時(shí)家兔的血脂水平(±s，n=8)

表1 第4周時(shí)家兔的血脂水平(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

正常對(duì)照組 —3.24±0.13 0.68±0.09 0.79±0.17 1.87±0.30模型對(duì)照組 — 11.36±2.71* 4.18±0.45* 0.91±0.24 6.68±0.39*ECFD組 2.5 8.52±1.66*△△ 2.93±0.83*△△ 1.22±0.21*△ 5.03±0.78*△△ECFD組 5.0 6.33±1.63*△△ 2.16±0.38*△△ 1.31±0.14*△△ 4.27±0.55*△△

表2 第8周時(shí)家兔的血脂水平(±s，n=8)

表2 第8周時(shí)家兔的血脂水平(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01;與模型對(duì)照組比較，△P＜0.01。

組 別 劑量/(g/kg) TC/(mmol/L) TG/(mmol/L) HDL－C/(mmol/L) LDL－C/(mmol/L)正常對(duì)照組 —3.22±0.14 0.71±0.11 0.77±0.15 1.77±0.24模型對(duì)照組 — 34.09±3.07* 12.55±1.99* 1.02±0.44 20.03±3.25*ECFD組 2.5 15.50±1.97*△ 5.77±1.48*△ 1.63±0.51*△ 12.10±2.35*△ECFD組 5.0 11.28±1.56*△ 3.16±1.33*△ 1.68±0.46*△ 7.94±1.64*△

2.2 ECFD對(duì)高脂血癥家兔動(dòng)脈粥樣硬化的影響

模型對(duì)照組家兔不同時(shí)期的AI值與正常對(duì)照組比均顯著升高(P＜0.01);ECFD預(yù)防組的AI值與同時(shí)期模型對(duì)照組比較顯著降低(P＜0.01)，但仍高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，結(jié)果表明ECFD通過(guò)調(diào)節(jié)血脂能抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成和促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的消退(見(jiàn)表3)。

表3 甘木通提取物對(duì)高脂血癥家兔不同時(shí)間AI值的影響(±s，n=8)

表3 甘木通提取物對(duì)高脂血癥家兔不同時(shí)間AI值的影響(±s，n=8)

注:與正常對(duì)照組比，*P＜0.01;與模型對(duì)照組比，△P＜0.01。

組 別 劑量/(g/kg) 第4周 第8周正常對(duì)照組 —3.11±0.15 3.18±0.13模型對(duì)照組 — 11.48±1.48* 34.42±1.76*ECFD組 2.5 5.98±0.94*△ 8.51±1.24*△ECFD組 5.0 3.82±0.89 5.71±1.01*△

3 討論

引起高脂血癥的原因有很多［4］，主要有三方面的原因:①遺傳因素，即原發(fā)性高脂血癥，又稱家族性高脂血癥，其病因尚未闡明;②患有易引起高脂血癥的疾病，這種情況稱為繼發(fā)性高脂血癥，如高血糖癥、糖尿病、肥胖、高尿酸血癥、肝臟疾病、腎臟疾病等;③飲食因素，飲食引起的高脂血癥與過(guò)高熱量、高膽固醇、高飽和脂肪酸有關(guān)，常同時(shí)伴有纖維素、植物蛋白不足。此外，年齡、性別、職業(yè)、吸煙、精神緊張都可導(dǎo)致高脂血癥。在眾多因素中，飲食因素是最常見(jiàn)、最主要的因素。在實(shí)驗(yàn)室中，建立高脂血癥模型常用的動(dòng)物有多種，而家兔在調(diào)脂新藥和動(dòng)脈粥樣硬化實(shí)驗(yàn)研究中是首選的動(dòng)物模型之一［5］。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，家兔用添加有膽固醇、蛋黃粉、豬油等成分的高脂飼料喂養(yǎng)4周時(shí)，血清TC、TG和LDL－C水平就有明顯升高，但動(dòng)脈硬化現(xiàn)象不很明顯，因此，本實(shí)驗(yàn)選用家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用高脂飼料喂養(yǎng)8周建立實(shí)驗(yàn)性高脂血癥動(dòng)物模型。

脂質(zhì)代謝異常是導(dǎo)致高血脂的直接原因，而高血脂又是引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因之一［6］。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與脂質(zhì)浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激、內(nèi)膜損傷、炎性反應(yīng)、血小板活化、血栓形成、血管平滑肌細(xì)胞激活、選擇性基質(zhì)代謝及血管重建等有密切關(guān)系［7－8］，但都不能獨(dú)立闡明動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制可能是:高脂血癥(尤其是TC、LDL－C升高)是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，而炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮損傷等參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程，并在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中起關(guān)鍵性作用。

研究表明，在引起動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素中，只有血漿TC水平升高才能夠在缺乏其他危險(xiǎn)因素的情況下，獨(dú)立地誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化［9］;而且大量的流行病學(xué)資料也證實(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度與血漿TC水平呈正相關(guān)［10］，HDLC濃度與動(dòng)脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)［11］。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不僅含有脂質(zhì)，還有大量的炎性細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有大量的炎性細(xì)胞，而且動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的嚴(yán)重程度與血清TC、TG、LDL－C水平一致，即模型對(duì)照組血脂水平最高，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊最明顯;ECFD預(yù)防組血脂水平顯著低于模型對(duì)照組，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊也明顯較小。結(jié)果表明，ECFD不僅能防止家兔實(shí)驗(yàn)性高脂血癥的形成，而且能抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

大量的研究表明［12］，黃酮類化合物具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌缺血、抗氧化等作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和甘木通中含有黃酮類化合物，推測(cè)甘木通的黃酮類成分是其調(diào)節(jié)血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化有效成分之一，但是還有許多問(wèn)題亟待解決:①發(fā)揮作用是否為黃酮類成分或者是黃酮類的哪一種?②降血脂機(jī)制是抑制脂質(zhì)吸收?還是抑制膽固醇合成?或是促進(jìn)膽固醇降解?③抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制等等，這些將有待于進(jìn)一步研究。

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