胡宗禮， 黃曉萍， 陳珺霞

(韶關學院英東生物工程學院，廣東韶關512005)

甘木通(Clematis filamentosa Dunn)為毛莨科鐵線蓮屬植物，用于防治冠心病、高血壓等療效顯著［1］。實驗發(fā)現(xiàn)，甘木通能顯著改善正常家兔的血液流變學特性［2］，但對動物高脂血癥的作用尚未見有報道。本實驗通過采用家兔實驗性高脂血癥模型，觀察甘木通乙醇提取物(extract of Clematis filamentosa Dunn，ECFD)對家兔高脂血癥的預防作用，為擴大甘木通的臨床應用范圍提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥材與試劑

甘木通藥材(由廣東雷霆國藥有限公司提供，采收于2008年11月);膽固醇(北京鼎國生物技術有限責任公司，批號:72710150);膽酸鹽(上海國藥集團化學試劑有限公司，批號:20070828);TG、TC、HDL－C 和 LDL－C 檢測試劑盒(湖南永和陽光科技有限責任公司，批號:20090420);分析純無水乙醇(天津市永大化學試劑開發(fā)中心);豬油、蛋黃、普通飼料等均為市售。

1.2 實驗動物

健康大白兔，購自廣東省從化市太平信華動物養(yǎng)殖場，體重1.5～2.0 kg，♂♀兼用，實驗動物生產許可證［SCXK(粵)2009－0023］。

1.3 主要儀器設備

OLYMPUS AU－640型全自動生化分析儀(日本);TG16－WS型臺式高速離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司);FW177型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);RE－52B型旋轉蒸發(fā)器(上海雅榮生化設備儀器有限公司);TC－120型智能程控生物組織全自動脫水機(湖北泰維醫(yī)療科技有限責任公司);珊頓325型石蠟切片機(英國);OLYMPUS－BX41型正置系統(tǒng)金像顯微鏡(日本);HPIS－2000型病理圖像分析系統(tǒng)(西安華海醫(yī)療信息技術股份有限公司)。

1.4 受試藥物及飼料的制備

1.4.1 受試藥物的制備

甘木通藥材經干燥、粉碎，過60目篩。以70%乙醇為提取溶劑，藥材與溶劑比例為1:20(W/V)，于90℃條件下加熱回流提取1 h，共提取3次，合并3次濾液，減壓回收乙醇后，進一步減壓濃縮至棕褐色膏狀(每1 g相當于原藥材5 g)，冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 高脂飼料的制備

普通飼經料粉碎后，按每100 g高脂飼料含膽固醇1.0 g、蛋黃粉5.0 g、豬油10.0 g、膽酸鹽0.5 g、普通飼料 83.5 g的比例配制，充分混合后，制備成顆粒狀飼料。

1.4.3 含ECFD飼料的制備

普通飼經料粉碎后，按每100 g飼料含ECFD 20 g、普通飼料80 g的比例配制，充分混合后制備成顆粒狀飼料。

1.5 實驗方法

1.5.1 模型制備與實驗分組

參照文獻方法［3］，家兔用普通飼料喂養(yǎng)2周后，從耳動脈取血測定血清TC、TG、HDL－C和 LDL－C含量，選擇結果較一致的家兔作為實驗動物。32只合格家兔隨機分成正常對照組、模型對照組、ECFD低劑量預防組和高劑量預防組，每組8只，所有家兔均單籠飼養(yǎng)。正常對照組家兔給予普通飼料喂養(yǎng);模型對照組家兔每天先給予高脂飼料50 g/kg;ECFD組每天先給予高脂飼料50 g/kg，然后給予含ECFD飼料12.5 g/kg(即ECFD 2.5 g/kg)和含ECFD飼料25 g/kg(即ECFD 5.0 g/kg)。各組飼料不足部分用普通飼料補充，自由飲水，連續(xù)喂養(yǎng)8周，每2周稱量一次家兔體重用于調整飼料量。

1.5.2 血脂測定

分別于第4周、第8周末取血按照試劑盒說明測定各項血脂指標，TG的測定采用酶比色法(GPO－POP法)，TC的測定采用 COD－CE－PAP 法，HDL－C 與 LDL－C 的測定采用直接法。

1.5.3 動脈硬化指數(shù)(arteriosclerotic index，AI)的計算［3］422

根據(jù)測定的血脂結果計算AI值，AI=(TC－HDL－C)/HDL－C

1.6 統(tǒng)計學處理

2 實驗結果

2.1 ECFD對家兔高脂血癥的預防作用

各組家兔喂養(yǎng)4周或8周時，模型對照組家兔血清TC、TG、LDL－C水平與正常對照組比顯著升高(P＜0.01)，而HDL－C水平僅呈升高趨勢(P＞0.05)。ECFD低劑量或高劑量給藥組家兔血清TC、TG、LDL－C水平與模型對照組比有顯著降低(P＜0.01)，血清HDL－C水平與正常對照組或模型對照組比均呈明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。結果提示，ECFD對家兔高脂血癥的形成具有一定的預防作用(見表 1、2)。

表1 第4周時家兔的血脂水平(±s，n=8)

表1 第4周時家兔的血脂水平(±s，n=8)

注:與正常對照組比較，*P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

正常對照組 —3.24±0.13 0.68±0.09 0.79±0.17 1.87±0.30模型對照組 — 11.36±2.71* 4.18±0.45* 0.91±0.24 6.68±0.39*ECFD組 2.5 8.52±1.66*△△ 2.93±0.83*△△ 1.22±0.21*△ 5.03±0.78*△△ECFD組 5.0 6.33±1.63*△△ 2.16±0.38*△△ 1.31±0.14*△△ 4.27±0.55*△△

表2 第8周時家兔的血脂水平(±s，n=8)

表2 第8周時家兔的血脂水平(±s，n=8)

注:與正常對照組比較，*P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.01。

組 別 劑量/(g/kg) TC/(mmol/L) TG/(mmol/L) HDL－C/(mmol/L) LDL－C/(mmol/L)正常對照組 —3.22±0.14 0.71±0.11 0.77±0.15 1.77±0.24模型對照組 — 34.09±3.07* 12.55±1.99* 1.02±0.44 20.03±3.25*ECFD組 2.5 15.50±1.97*△ 5.77±1.48*△ 1.63±0.51*△ 12.10±2.35*△ECFD組 5.0 11.28±1.56*△ 3.16±1.33*△ 1.68±0.46*△ 7.94±1.64*△

2.2 ECFD對高脂血癥家兔動脈粥樣硬化的影響

模型對照組家兔不同時期的AI值與正常對照組比均顯著升高(P＜0.01);ECFD預防組的AI值與同時期模型對照組比較顯著降低(P＜0.01)，但仍高于正常對照組(P＜0.01)，結果表明ECFD通過調節(jié)血脂能抑制動脈粥樣硬化的形成和促進動脈粥樣硬化的消退(見表3)。

表3 甘木通提取物對高脂血癥家兔不同時間AI值的影響(±s，n=8)

表3 甘木通提取物對高脂血癥家兔不同時間AI值的影響(±s，n=8)

注:與正常對照組比，*P＜0.01;與模型對照組比，△P＜0.01。

組 別 劑量/(g/kg) 第4周 第8周正常對照組 —3.11±0.15 3.18±0.13模型對照組 — 11.48±1.48* 34.42±1.76*ECFD組 2.5 5.98±0.94*△ 8.51±1.24*△ECFD組 5.0 3.82±0.89 5.71±1.01*△

3 討論

引起高脂血癥的原因有很多［4］，主要有三方面的原因:①遺傳因素，即原發(fā)性高脂血癥，又稱家族性高脂血癥，其病因尚未闡明;②患有易引起高脂血癥的疾病，這種情況稱為繼發(fā)性高脂血癥，如高血糖癥、糖尿病、肥胖、高尿酸血癥、肝臟疾病、腎臟疾病等;③飲食因素，飲食引起的高脂血癥與過高熱量、高膽固醇、高飽和脂肪酸有關，常同時伴有纖維素、植物蛋白不足。此外，年齡、性別、職業(yè)、吸煙、精神緊張都可導致高脂血癥。在眾多因素中，飲食因素是最常見、最主要的因素。在實驗室中，建立高脂血癥模型常用的動物有多種，而家兔在調脂新藥和動脈粥樣硬化實驗研究中是首選的動物模型之一［5］。我們在預實驗中發(fā)現(xiàn)，家兔用添加有膽固醇、蛋黃粉、豬油等成分的高脂飼料喂養(yǎng)4周時，血清TC、TG和LDL－C水平就有明顯升高，但動脈硬化現(xiàn)象不很明顯，因此，本實驗選用家兔作為實驗動物，用高脂飼料喂養(yǎng)8周建立實驗性高脂血癥動物模型。

脂質代謝異常是導致高血脂的直接原因，而高血脂又是引發(fā)動脈粥樣硬化的重要原因之一［6］。動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與脂質浸潤、氧化應激、內膜損傷、炎性反應、血小板活化、血栓形成、血管平滑肌細胞激活、選擇性基質代謝及血管重建等有密切關系［7－8］，但都不能獨立闡明動脈粥樣硬化的形成機制可能是:高脂血癥(尤其是TC、LDL－C升高)是動脈粥樣硬化的始動因素，而炎癥、氧化應激、內皮損傷等參與動脈粥樣硬化的發(fā)病過程，并在動脈粥樣硬化的形成中起關鍵性作用。

研究表明，在引起動脈粥樣硬化的危險因素中，只有血漿TC水平升高才能夠在缺乏其他危險因素的情況下，獨立地誘發(fā)動脈粥樣硬化［9］;而且大量的流行病學資料也證實，動脈粥樣硬化的嚴重程度與血漿TC水平呈正相關［10］，HDLC濃度與動脈粥樣硬化呈負相關［11］。動脈粥樣硬化斑塊不僅含有脂質，還有大量的炎性細胞。本實驗中，在動脈粥樣硬化斑塊內也發(fā)現(xiàn)有大量的炎性細胞，而且動脈粥樣硬化斑塊的嚴重程度與血清TC、TG、LDL－C水平一致，即模型對照組血脂水平最高，動脈粥樣硬化斑塊最明顯;ECFD預防組血脂水平顯著低于模型對照組，動脈粥樣硬化斑塊也明顯較小。結果表明，ECFD不僅能防止家兔實驗性高脂血癥的形成，而且能抑制動脈粥樣硬化的形成。

大量的研究表明［12］，黃酮類化合物具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗心肌缺血、抗氧化等作用。結合本實驗結果和甘木通中含有黃酮類化合物，推測甘木通的黃酮類成分是其調節(jié)血脂和抗動脈粥樣硬化有效成分之一，但是還有許多問題亟待解決:①發(fā)揮作用是否為黃酮類成分或者是黃酮類的哪一種?②降血脂機制是抑制脂質吸收?還是抑制膽固醇合成?或是促進膽固醇降解?③抗動脈粥樣硬化的機制等等，這些將有待于進一步研究。

［1］傅銳斌，邱 建，馬 駿，等.冠心康片治療冠心病心絞痛臨床療效研究［J］. 中藥材，2005，28(11):1045－1046.

［2］黃曉萍，胡宗禮，陳珺霞.甘木通提取液對家兔血液流變學的影響［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2009，8(3):29－30.

［3］李儀奎主編.中藥藥理實驗方法學［M］.第2版，上海:上?？茖W技術出版社，2006，619－620.

［4］金志清，關會濤.引發(fā)高血脂癥的因素及防治［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2009，30(2):191－192.

［5］劉雪梅，吳符火.幾類高脂血癥動物模型的比較［J］.中西醫(yī)結合學報，2004，2(2):132－134.

［6］Lusis A J.Atherosclerosis［J］.Nature，2000，407:233－241.

［7］李貴星，劉雙鳳.動脈粥樣硬化發(fā)病機制的研究進展［J］.中國實驗診斷學，2007，11(9):1268－1271.

［8］張向明.高脂血癥與心腦血管疾病相關因素探討［J］.中國誤診學雜志，2008，8(5):1038－1039.

［9］Gouni－Berthold I，Sachinidis A.Possible non－classic intracellular and molecular mechanism of LDL cholesterol action contributing to the development and progression of atherosclerosis［J］.Curr Vasc Pharmacol，2004，2(4):363－370.

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［12］郭雪微，盧 梃，王雪里紅.天然黃酮類化合物在心腦血管疾病中應用進展［J］.中國老年學雜志，2006，26(4):1001－1003.