周 軍， 周 麗， 曾慶仁， 侯德仁， 陳 坤， 田 怡， 萬(wàn) 順

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2.湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，3.湘雅三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南長(zhǎng)沙410013)

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理特征為腦組織萎縮、老年斑和大量的β－淀粉樣蛋白(β － amyloid protein，Aβ)沉積［1，2］。目前仍缺乏特效及安全的治療方法，因此開(kāi)展對(duì)AD發(fā)病機(jī)制研究和有效的篩選防治AD的藥物就成為醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)。AD的發(fā)病主要學(xué)說(shuō)為凝聚態(tài)Aβ在腦實(shí)質(zhì)的沉積，啟動(dòng)病理級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞纖維纏結(jié)形成，神經(jīng)元丟失和癡呆表現(xiàn)［3］。另外與機(jī)體氧自由基產(chǎn)生增加、清除能力下降，伴有一個(gè)緩慢的炎癥病理改變過(guò)程等因素有關(guān)［4］。同時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在上述因素作用下活化分泌大量細(xì)胞因子，激活補(bǔ)體，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，在AD的病變中也起重要作用。

丹皮酚(Pae)是從毛莨科植物牡丹根皮和蘿摩科植物徐長(zhǎng)卿干燥根或全草中提取出來(lái)的一種活性成分.對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和消炎抗氧化及保護(hù)心腦血管等廣泛的藥理活性，臨床上廣泛用于治療炎癥，增強(qiáng)免疫力、鎮(zhèn)痛和抗心律失常等心腦血管疾病［5］。

目前，丹皮酚作用及其機(jī)制的研究不斷拓展和深入，由于其分子量小，極易透過(guò)細(xì)胞膜，作用類似于通道的阻滯劑，還具有抗自由基的作用，故有可能成為一種很好的用于研究治療AD疾病的藥物。本實(shí)驗(yàn)在觀察Aβ所引起神經(jīng)毒作用的同時(shí)，也探索了丹皮酚在Aβ沉積在腦組織后所發(fā)揮的作用以及干預(yù)后的腦組織GFAP和S100β表達(dá)水平的變化，為臨床應(yīng)用丹皮酚治療AD疾病尋找了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 纖維型 Aβ1－42的制備

取 1 mg Aβ1－42(美國(guó) Sigma公司)溶于 500 μL 注射用生理鹽水中，置于37℃恒溫箱中孵育時(shí)用微細(xì)磁力攪拌子充分?jǐn)嚢璩掷m(xù)1周，使其成為聚集狀態(tài)的纖維型Aβ1－42，置于4℃冰箱中備用。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

成年SD♂性大鼠24只，體重180～220 g(由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，其中隨機(jī)取16只建立AD模型，8只作為正常對(duì)照組。建模方法:將SD大鼠用10%水合氯醛(0.35 mg/kg)麻醉后置于腦立體定位儀上，切開(kāi)皮膚，找到前囪所在位置，參考大鼠圖譜確定前囪后3.0 mm，中線旁2.0 mm為海馬的所在的體表投影位置，以牙科鉆鉆開(kāi)一骨窗，將微量注射器固定在立體定位儀上，進(jìn)針約2.8 mm，緩慢均勻注入纖維型 Aβ1－42溶液10 μg/5 μL，5 min 注射完畢，留針5 min，然后緩慢撤針，術(shù)后縫合皮膚。對(duì)照組按照模型制備的全過(guò)程在腦內(nèi)注射生理鹽水5 μL。建模成功后隨機(jī)分為模型組和Pae用藥組，Pae用藥組用丹皮酚0.5 mg/(kg/d)(寧波天真制藥有限公司生產(chǎn))腹腔注射，持續(xù)40 d。模型組與正常組腹腔內(nèi)注射同容積的生理鹽水并平行給予常規(guī)飲食及正?；顒?dòng)。

1.3 腦組織切片的制備

模型建立與干預(yù)治療40 d后，將對(duì)照組、Pae組和模型組三組大鼠用10%水合氯醛(0.35 mg/kg)深深麻醉，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注0.01 mol/L PBS，待大鼠的肝臟顏色變淺，然后改以新鮮配制的4%多聚甲醛灌注，流速約為10 mL/min，并取腦組織置于4%多聚甲醛溶液中冰箱后固定過(guò)夜，次日用0.01M PBS反復(fù)浸洗，最后將腦組織梯度酒精脫水，透明，石蠟包埋，冠狀切片(厚約5 μm)備用。

1.4 免疫組織化學(xué)主要試劑和實(shí)驗(yàn)方法

脫蠟切片入PBS緩沖液，在抗原修復(fù)液(美國(guó)Vector，H－3300)80°C存放20 min，待自然冷卻后，緩沖液清洗2次，再入3%H2O2室溫下5 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清中1 h，以減少組織非特異性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中所用抗體6E10購(gòu)于美國(guó)Covance公司(SIG－39340，1∶1000);NeuN 購(gòu)于 Chemicon 公司(MAB－377，1 ∶1000);GFAP購(gòu)于DAKO公司(Z0334 1∶1000)，S100β購(gòu)于 Sigma，(S2657，1∶100)。切片分別在1%小牛血清與0.1%Triton和上述抗體的混合液中4°C冰箱孵育過(guò)夜，次日經(jīng)緩沖液洗滌3次后，加相應(yīng)二抗(1∶400)溶液，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3次后，加生物素與卵白素結(jié)合(ABC)試劑盒配置的混合液中再孵育1 h。底物呈色反應(yīng)采用DAB試劑盒。所有二抗、ABC和DAB試劑盒均購(gòu)自美國(guó)vector公司。呈色反應(yīng)后，切片經(jīng)逐級(jí)脫水并用加拿大中性樹(shù)膠封片。

1.5 Western印跡法檢測(cè)大鼠腦組織GFAP的表達(dá)

0.01 MPBS經(jīng)左心室灌注以去除血細(xì)胞干擾，然后取腦組織分別置于預(yù)冷的蛋白質(zhì)抽提緩沖液(20 mmol/L Tris－Cl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，1%Triton X－100，10%蛋白酶抑制劑混合物，1%磷酸酶抑制劑混合物)中，充分勻漿后，4℃12 000 g離心15 min，去除細(xì)胞碎片，吸取上清液，即為腦組織總蛋白質(zhì)，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，立即用于蛋白質(zhì)印跡分析。每個(gè)樣本采用20 μg蛋白質(zhì)在10%SDS－PAGE凝膠中電泳分離，電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，印跡膜在含5%BSA的TBS緩沖液中封閉1 h，在抗 GFAP(DAKO 1∶1000)溶液中4℃孵育過(guò)夜;TBST漂洗膜3次，每次10 min;在HRP標(biāo)記的二抗溶液中室溫孵育2 h，TBST漂洗膜3次，每次10 min;上述處理后的PVDF膜通過(guò)化學(xué)發(fā)光電泳圖像處理系統(tǒng)ECL檢測(cè)顯色獲得Western印跡反應(yīng)圖譜。最后以GAPDH(Chemicon 1∶300)抗體做內(nèi)參照。GFAP和GAPDH片段的條帶光密度比值為相對(duì)值分別進(jìn)行比較。

1.6 動(dòng)物行為學(xué)分析

大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力通過(guò)電迷宮箱進(jìn)行測(cè)試，將各組大鼠分別放入三等份輻射式Y(jié)型迷宮箱中適應(yīng)3～5 min后，給予適當(dāng)電擊，至其等長(zhǎng)的3臂均探索進(jìn)入為止，觀察動(dòng)物學(xué)會(huì)逃離電擊區(qū)而進(jìn)入安全區(qū)的反應(yīng)能力，記錄每個(gè)動(dòng)物在造模前和造模后正確逃避反應(yīng)被電擊的次數(shù)。

1.7 圖象采集及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在日本產(chǎn)Nikon Eclipse 80i顯微鏡下觀察結(jié)果，并用Nikon DS高分辨率數(shù)碼像機(jī)經(jīng)NIS－Elements AR 3.0軟件拍照。對(duì)腦組織切片均通過(guò)拍照收集皮質(zhì)和海馬切面圖像。結(jié)果分析，采用Ver.3.00程序軟件作圖像數(shù)字采集及半定量分析(以著色面積占組織切片總面積的比例確定為標(biāo)志物免疫組化的陽(yáng)性數(shù)值。)結(jié)果評(píng)估采用單一方差分析，Excel軟件統(tǒng)計(jì)制表。

2 結(jié)果

2.1 β淀粉樣蛋白在模型組和Pae組的腦組織的表達(dá)

6E10(Aβ1－16)抗體標(biāo)記腦組織的溶解或聚集狀態(tài)β淀粉樣蛋白。顯微鏡下觀察在正常對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)β淀粉樣蛋白的沉積，而模型組和Pae組可見(jiàn)海馬中央以及皮質(zhì)中線旁Aβ注射區(qū)可見(jiàn)有大小不等分布不均的6E10抗體陽(yáng)性反應(yīng)顆粒表達(dá)，兩組比較沒(méi)有明顯的差異(P＞0.05)(圖1)。

圖1 β淀粉樣蛋白在模型組和Pae組的腦組織表達(dá)

2.2 丹皮酚對(duì)β淀粉樣蛋白的神經(jīng)細(xì)胞毒性影響

神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記抗體NeuN染色顯示，在模型組和Pae組的Aβ注射的腦組織皮質(zhì)區(qū)和海馬CA3區(qū)可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞大小不一，部分神經(jīng)細(xì)胞萎縮變形，神經(jīng)細(xì)胞帶受損，細(xì)胞數(shù)量減少。Pae組病變程度較輕，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)上述改變(P＜0.05)(圖2)。

圖2 對(duì)β淀粉樣蛋白的神經(jīng)細(xì)胞毒性影響(×400)

2.3 各組大鼠腦組織S100β和GFAP蛋白的表達(dá)

S100β蛋白和GFAP在各組大鼠腦組織均有表達(dá)，正常對(duì)照組的S100β陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞染色較淺，Pae和模型組的陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞增多，染色反應(yīng)增強(qiáng)，海馬區(qū)和皮質(zhì)部位均有明顯的表達(dá)，兩組反應(yīng)與對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。

圖3 對(duì)大鼠腦組織S-100β的蛋白的表達(dá)

GFAP在對(duì)照組的陽(yáng)性反應(yīng)弱，細(xì)胞小，模型組反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞體積增大，腦組織海馬和皮質(zhì)部位表達(dá)部位廣泛，Pae組GFAP比對(duì)照組反應(yīng)深，但明顯比模型組減弱，Western Blot定量與免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果一致。(圖4)。

圖4 對(duì)大鼠腦組織GFAP蛋白的表達(dá)

2.4 三組大鼠海馬和皮質(zhì)中6E10、NeuN和S100β陽(yáng)性反應(yīng)半定量統(tǒng)計(jì) 見(jiàn)表1。

表1 大鼠海馬和皮質(zhì)中6E10、NeuN和S100β陽(yáng)性反應(yīng)半定量統(tǒng)計(jì)

2.5 動(dòng)物行為學(xué)分析

學(xué)習(xí)記憶強(qiáng)、主動(dòng)逃避反應(yīng)較敏感的大鼠電擊次數(shù)較少，表明大鼠已經(jīng)形成了正確反應(yīng)率。反應(yīng)過(guò)于遲鈍的大鼠電擊次數(shù)增多，造模前大鼠主動(dòng)逃避反應(yīng)較敏感的大鼠電擊次數(shù)無(wú)明顯差異，造模后模型組大鼠反應(yīng)較遲鈍，電擊次數(shù)增多，而Pae組大鼠主動(dòng)逃避反應(yīng)較敏感，電擊次數(shù)減少(P＜0.05)。

圖5 造模前后各組動(dòng)物主動(dòng)逃避反應(yīng)的電擊次數(shù)比較

3 討論

目前認(rèn)為Aβ的過(guò)量產(chǎn)生是AD病理的重要誘發(fā)因素之一［6］，已知腦內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)毒作用的 Aβ 主要是 Aβ1－40和Aβ1－42。雖然實(shí)驗(yàn)用β淀粉樣蛋白是人工合成，但不少研究證明它幾乎和內(nèi)生性的Aβ1－42有同等毒性作用，以聚集狀態(tài)的β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的病變與AD的病理改變十分相似［7，8］。表現(xiàn)在神經(jīng)元退行性病變和 NFT中雙螺旋絲(PHF)的形成，激活膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以及升高胞內(nèi)Ca2+，使神經(jīng)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)等。

另一主要表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的S100β是生理狀態(tài)下神經(jīng)元發(fā)育和軸突生長(zhǎng)中發(fā)揮重要的作用蛋白之一，近年來(lái)臨床病理分析卻發(fā)現(xiàn)S100β隨年齡有上升趨勢(shì)，AD患者的 S100β含量遠(yuǎn)高于正常老年組［9］。S100β蛋白對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用依賴于濃度水平:低濃度有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，高濃度S100β具有神經(jīng)毒作用，能升高神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，誘發(fā)神經(jīng)元變性、神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死。因此，S100β蛋白的過(guò)度表達(dá)多通常作為神經(jīng)退化性疾病的一個(gè)標(biāo)志［10，11］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以聚集狀態(tài)的β淀粉樣蛋白進(jìn)行大鼠背側(cè)細(xì)胞帶微量注射，用免疫組織化學(xué)的方法以6E10抗體反應(yīng)證實(shí)，纖維型Aβ以不溶解狀態(tài)成大分子而不被吸收，并持續(xù)性的保留在腦組織內(nèi)，導(dǎo)致神經(jīng)毒性使腦組織神經(jīng)元退行性變，注射區(qū)可見(jiàn)Aβ沉積，說(shuō)明模型是成功的。注射區(qū)神經(jīng)細(xì)胞大小不一，有的呈萎縮狀態(tài)。皮質(zhì)局部有些神經(jīng)細(xì)胞死亡消失，膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞有局部缺損，CA3的部位更明顯，神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)不同形態(tài)學(xué)變化，使細(xì)胞帶受損，同時(shí)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，膠質(zhì)細(xì)胞增多。研究還發(fā)現(xiàn)，外源性給予的 Aβ1－42損傷神經(jīng)元后，并導(dǎo)致腦組織GFAP 和 S100β 蛋白含量增加［12］。

本實(shí)驗(yàn)觀察，AD模型鼠經(jīng)丹皮酚干預(yù)治療后，大大減輕了神經(jīng)元損傷和減少了GFAP和S100β的陽(yáng)性反應(yīng)。其機(jī)理可能是通過(guò)抑制GFAP和S100β的過(guò)度表達(dá)，減少炎癥因子的產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡和損傷，提高了細(xì)胞清除氧自由基的能力，維護(hù)細(xì)胞膜的電解質(zhì)穩(wěn)定，達(dá)到抗氧化作用，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用，進(jìn)而也明顯改善了動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶功能。因此，補(bǔ)充丹皮酚可改善由Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒作用。以上研究有助于拓寬中藥治療老年癡呆癥的認(rèn)識(shí)，為中藥治療老年癡呆癥的臨床應(yīng)用提供一些新的研究資料。

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