孫穎楨， 陳科力， 劉 震

(1.省部共建中藥資源和中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065;2.紫瑯職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，江蘇南通226002)

江南卷柏是卷柏科植物江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron的全草，用于治療各種疾病出血、血小板減少癥，以及急性黃疸型傳染性肝炎等多種疾?。?］?！稄V西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》將其作為石上柏的原植物之一收載，用于癌癥及多種炎癥的治療［2］。江南卷柏所含的化學(xué)成分主要為雙黃酮類(lèi)，包括穗花杉雙黃酮、雞毛松雙黃酮A和B、4′－甲醚－羅波斯塔雙黃酮、羅波斯塔雙黃酮、扁柏雙黃酮等，還含有3種黃酮苷類(lèi)［3，4］，其中穗花杉雙黃酮的含量較高。黃酮類(lèi)具有抗炎、抗氧化的作用，穗花杉雙黃酮具有抗腫瘤，抗病毒，血管舒張作用［5］，因此，總黃酮是江南卷柏的主要活性部位。炎癥與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)［6］，環(huán)氧化酶－2(COX－2)是炎癥介質(zhì)分子前列腺素合成關(guān)鍵的限速酶，它在腫瘤組織中的高度表達(dá)，使它成為抗癌藥研究的一個(gè)重要的靶點(diǎn)［7］。COX－2可反映在蛋白質(zhì)水平及mRNA水平上，本實(shí)驗(yàn)考察江南卷柏總黃酮對(duì)COX－2 mRNA水平的調(diào)節(jié)作用，探討江南卷柏總黃酮可能的抗腫瘤作用及其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞系

結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞系，購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。培養(yǎng)液為RPMI－1640加10%新生牛血清、100 ng/mL的青霉素和鏈霉素，常規(guī)條件培養(yǎng)(5%CO2，37℃，下同)。

1.2 儀器及試劑

潔凈工作臺(tái) (上海博迅);倒置顯微鏡 (OLYMPUS);CO2培養(yǎng)箱 (Sheldon);紫外檢測(cè)儀(Hitachi U－2001日立公司);基因擴(kuò)增儀(Biometra德國(guó));電泳儀(DYY－8C北京);凝膠成像分析儀(WD－9413A北京);新生牛血清(武漢三利);RPMI－1640(Sigma);DMSO(Amresco);oligodT18、Rnasin(上海捷瑞);BIOZOL裂解液、DEPC、Marker等(北京天根);引物均由上海生工合成。

1.3 材料和藥物樣品

江南卷柏Selaginella moellendorfii Hieron.系蕨類(lèi)卷柏科卷柏屬Selaginella植物，于2004年8月采集于湖北宜昌霧渡河，原植物由湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定，標(biāo)本留存于湖北中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本室。江南卷柏總黃酮為本實(shí)驗(yàn)室按文獻(xiàn)從江南卷柏中提取制備［8］，江南卷柏總黃酮中黃酮類(lèi)成分的含量大于50%，其中穗花衫雙黃酮含量為40%以上。江南卷柏總黃酮用DMSO溶解制得100 mg/mL的樣品貯備液。

2 方法

2.1 藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

采用氮藍(lán)四唑鹽實(shí)驗(yàn)(MTT法)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞稀釋至5×105/mL，接種于96孔板，200 μL/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄取原培養(yǎng)液，加入用培養(yǎng)液稀釋的樣品貯備液，使其終濃度分別為 100、50、25、12.5 μg/mL，對(duì)照組加同體積培養(yǎng)液，每組設(shè)4復(fù)孔，設(shè)3個(gè)時(shí)間梯度24 h、48 h、72 h，藥物作用結(jié)束后，去除培養(yǎng)液，加入 MTT 5 mg/mL，20 μL/孔，37 ℃孵育 4 h，加入 DMSO 150 μl/孔，震蕩溶解 10 min，570 nm 測(cè)各孔吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。分別計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50(抑制一半細(xì)胞生長(zhǎng)所需的藥物濃度)。抑制率=(1—A給藥孔/A對(duì)照孔)×100%。

2.2 RT－PCR 法檢測(cè)藥物對(duì) HT－29 細(xì)胞 COX－2mRNA 表達(dá)的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞HT－29細(xì)胞接種至6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后加入樣品貯備液使其終濃度分別為:40 μg/mL(高劑量組)、20 μg/mL(中劑量組)、10 μg/mL(低劑量組)、0 μg/mL(陰性對(duì)照組)，培養(yǎng)24 h。藥物作用后，用BIOZOL裂解提取RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提RNA的完整性。用微量比色皿在紫外下檢測(cè)RNA的純度及濃度，并將各組總RNA濃度調(diào)整至同一水平。各組取等量RNA 加入 1 μL oligodT18，Rnasin 1 μL，dNTP 1 μL，MLV 1 μL，5 ×buffer 10 μL，在 50 μL 體積下，42 ℃水浴 60 min，沸水浴3 min，冰浴3 min，得cDNA。完成逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)后，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。COX－2引物序列如下:上游5′－GTC TGA TGA TGT ATG CCA CAA TCT G－3′，下游 5′－GAT GCC AGT GAT AGA GGG TGT TAA A－3′，反應(yīng)產(chǎn)物理論大小為 275 bp;β－actin 引物序列如下:上游5′－CCC AGC ACA ATG AAG ATC AA－3′，下游 5′－TTT CTG CGC AAG TTA GGT TTT GAC AA－3′，反應(yīng)產(chǎn)物理論大小為234 bp。反應(yīng)條件為:95℃，預(yù)變性5 min;94℃，1 min變性;58℃ 50 s退火;72℃ 90 s延伸，循環(huán)40次，72℃最終延伸10 min。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用電泳凝膠成像自動(dòng)分析儀檢測(cè)各擴(kuò)增帶的產(chǎn)物，結(jié)果用下列公式表示:COX－2 灰度值 =COX－2mRNA 密度/β－actin mRNA密度。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0分析。組間差異進(jìn)行t檢驗(yàn)處理，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

江南卷柏總黃酮干預(yù)后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性，25～100 μg/mL抑制細(xì)胞增殖較明顯，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 江南卷柏總黃酮對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(IC50)

3.2 半定量檢測(cè)樣品對(duì) HT－29細(xì)胞 COX－2mRNA表達(dá)的影響

RT－PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，所測(cè)灰度值見(jiàn)表2。

圖1 RT-PCR反應(yīng)結(jié)果圖

表2 各組COX-2mRNA表達(dá)水平(n=6)

4 小結(jié)和討論

本實(shí)驗(yàn)考察了江南卷柏總黃酮處理24 h對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT－29 COX－2 mRNA的影響，結(jié)果顯示江南卷柏總黃酮在濃度為20 μg/mL 和40 μg/mL 時(shí)能顯著下調(diào) COX－2mRNA 的水平，且呈現(xiàn)量效關(guān)系(圖1、表2)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)江南卷柏總黃酮對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT－29的生長(zhǎng)有一定抑制作用，且呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的依賴(lài)性(表1)，但作用較為溫和，其作用48 h時(shí)IC50為 108 μg/mL。

COX－2在各腫瘤組織中都有較高的表達(dá)，本文證明江南卷柏總黃酮能在mRNA水平上抑制COX－2的蛋白質(zhì)表達(dá)，降低PGE2產(chǎn)量，這可能是江南卷柏抗腫瘤作用的機(jī)制之一。本研究為卷柏屬藥用植物黃酮類(lèi)提取物用于癌證治療提供了一定的理論依據(jù)，將有助于拓展卷柏的藥用價(jià)值。

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