馬 麗， 胡曉靈

(新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy DPN)是因糖尿病慢性高血糖狀態(tài)及其所致各種病理生理改變而導致的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可累及全身神經(jīng)系統(tǒng)任何部分，是糖尿病最常見和最復雜的并發(fā)癥，累及超過50%的糖尿病患者［1］可以出現(xiàn)DPN。DPN的發(fā)病機理主要涉及代謝障礙和血管障礙兩方面。在臨床上DPN的癥狀很難處理，目前尚缺乏有效的治療方法，多數(shù)藥物的臨床效果還有待進一步證實，中醫(yī)藥在治療慢性疾病中有確切的優(yōu)勢，研究臨床療效可靠的中藥治療DPN，具有非常重要的實際意義。

由于糖尿病的高血糖狀態(tài)，脂蛋白易發(fā)生糖基化，糖化血紅蛋白不易被血液清除而沉積于血管壁，促進動脈硬化形成。而且多元醇通路活性增高，使神經(jīng)細胞高滲腫脹變形，周圍神經(jīng)出現(xiàn)髓鞘分離、脫失，并影響肌醇和?；撬岽x，減少 NO 合成，導致神經(jīng) Na+，K+－ATP 酶活性的降低［2］，致細胞結構和功能損壞。本實驗以血糖、糖化血紅蛋白、神經(jīng)電生理、Na+，k+－ATP酶等指標，驗證絡必通顆粒對DM大鼠周圍神經(jīng)病變的治療作用。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，♀♂各半，體重(150±20)g，150只，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證:新醫(yī)動字SLXK(新)2003－0001。♀♂大鼠分別分籠飼養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)5只，室溫(23±2)°C，相對濕度50% ～60%，通風良好，自由攝食、飲水。

1.2 實驗藥物

絡必通顆粒，由新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院研制，批號(0504202224);糖脈康顆粒，中國中醫(yī)研究院中匯制藥公司生產(chǎn)，批號:(050802)。

1.3 主要試劑(略)、主要儀器(略)

2 方法

2.1 動物造模

2.1.1 2型糖尿病模型建立［3］

首先選擇合格大鼠，♀♂各半，體重(150±20)g，模型組大鼠喂以高脂飼料(其中含70%碳水化合物、20%蔗糖，10%豬油)連續(xù)兩個月，誘發(fā)出胰島素抵抗;繼以小劑量STZ 35 mg/kg(鏈脲佐菌素溶于0.1 mol/L，pH4.5的檸檬酸緩沖液，STZ配制為1%的溶液)，于大鼠禁食14 h后腹腔注射;然后繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，用葡萄糖氧化酶法及放射免疫法測空腹血糖及胰島素水平，并據(jù)公式求出胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index ISI)。每周測定大鼠的體重、飲水量和進食量?？瞻讓φ战M予以正常飲食并給予檸檬酸緩沖液平行進行實驗?？瞻捉M和模型組動物分籠飼養(yǎng)，自由進食和飲水。

2.1.2 2型糖尿病周圍神經(jīng)病變模型建立

在上述模型基礎上持續(xù)觀察8周，用肌電圖儀分別采用在體直接和間接的測定方法［4］，測定動物坐骨神經(jīng)傳導速度及尾神經(jīng)傳導速度［5］。判定糖尿病周圍神經(jīng)病變模型的確立。

2.2 分組與給藥

將模型鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為5組，分別為模型組、陽性對照組(糖脈康組)、絡必通治療組(包括小、中、大劑量)。絡必通顆粒為1.17，2.34，4.68 g/kg 3個劑量每日灌胃;陽性對照組予以糖脈康1.56g/kg灌胃;模型組、正常對照組均灌以相應容積的蒸餾水，每日1次，正常飲食，用藥共計8周。

2.3 Na+，K+－ATP 酶活性的測定方法

用藥8周后，取大鼠右側坐骨神經(jīng)，并準確稱取坐骨神經(jīng)的重量，按重量體積比加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，1 000～3 000 r/min，離心10 min，然后取組織勻漿上清再以生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿，用于測定組織蛋白。

采用商品試劑盒，按照試劑說明在722分光光度計上進行測定。ATP酶可分解ATP生成ADP及無機磷，通過測定無機磷的量可判斷ATP酶活性的大小。將每小時每毫克組織蛋白的ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol/L無機磷的量定義為一個ATP酶活性單位。計算公式如下:

組織中 Na+，K+－ATPase活力(U/mgprot)= ［(測定管OD值－對照管OD值)/(標準管OD值－空白管OD值)］×標準管濃度(0.02 μmol/mL)×6×7.8÷勻漿蛋白濃度(mgprot/mL)

2.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，并對變量進行方差齊性檢驗，方差齊性齊時，兩組比較用兩樣本均數(shù)t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。方差不齊時用非參數(shù) t檢驗(Kolmo－gorov－Smirnov檢驗或Kruskal－Wallis檢驗)。檢驗水準定為α=0.05。

結 果

1 DPN模型(坐骨神經(jīng)與尾神經(jīng)肌電圖結果)

兩組動物在第20周測定坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)傳導速度和潛伏期及尾神經(jīng)感覺神經(jīng)傳導速度和潛伏期，確定DPN動物模型成立，共計89例。結果顯示:兩種方法測出的坐骨神經(jīng)MNCV均減慢，尾神經(jīng)SNCV較正常組減慢，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在體直接法潛伏期較正常組延長且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而在體間接法所測MNCV潛伏期和尾神經(jīng)較正常組雖延長，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。依據(jù)神經(jīng)傳導速度判定DPN動物模型建立成功。(表1、2)。因方差齊，兩組比較采用t檢驗。

表1 坐骨神經(jīng)肌電圖兩組比較(±s)

表1 坐骨神經(jīng)肌電圖兩組比較(±s)

MNCV/(m/s間接法分組 樣本數(shù)/個潛伏期/s直接法MNCV/(m/s)直接法潛伏期/s間接法正常組 20 0.92±0.16 42.74±6.99 1.83±0.17 48.73±8.68模型組 89 1.09±0.27 33.41±7.01 1.98±0.34 35.80±6.20

表2 尾神經(jīng)肌電圖兩組比較(±s)

表2 尾神經(jīng)肌電圖兩組比較(±s)

分組 樣本數(shù)/個 潛伏期/s SNCV/(m/s)正常組20 2.53±0.45 48.99±5.16模型組89 2.72±0.50 44.00±7.07

2 絡必通顆粒對DPN大鼠肌電圖的影響

2.1 絡必通顆粒對DPN大鼠坐骨神經(jīng)肌電圖的影響

造模20周，DPN大鼠模型成立共計89例，隨機分配至5組，經(jīng)藥物治療8周后，DPN大鼠死亡18只，正常對照組死亡2只。結果:DPN大鼠經(jīng)藥物治療，各給藥組大鼠運動神經(jīng)傳導速度較模型組有明顯的加快，其中絡必通大中劑量組提高更明顯，優(yōu)于陽性藥物組，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 絡必通顆粒對坐骨神經(jīng)肌電圖的影響(±s)

表3 絡必通顆粒對坐骨神經(jīng)肌電圖的影響(±s)

分組 樣本數(shù)/個/s正常對照組 18 45.83±5.04 1.13±0.14 52.20±2.85 2.72±0.47直接法MNCV/(m/s) 潛伏期/s間接法MNCV/(m/s) 潛伏期模型組 16 31.65±3.73 1.51±0.22 32.65±5.23 2.68±0.48陽性藥物組 13 37.13±3.16 1.32±0.12 43.85±3.96 2.66±0.47絡必通小劑量 14 38.11±2.70 1.21±0.13 42.61±4.30 3.07±0.46絡必通中劑量 13 40.56±3.26 1.16±0.96 48.26±4.38 2.89±0.50絡必通大劑量 15 42.76±3.88 1.16±0.10 47.94±3.85 2.55±0.35

2.2 絡必通對DPN大鼠尾神經(jīng)肌電圖的影響

各給藥組大鼠經(jīng)治療，SNCV均較模型組有所提高，其中絡必通大劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

表4 絡必通對尾神經(jīng)肌電圖的影響(±s)

表4 絡必通對尾神經(jīng)肌電圖的影響(±s)

18 37.28±5.56 3.39±0.57模型組 16 31.41±2.41 3.67±0.42陽性藥物組 13 34.13±3.38 3.54±0.47絡必通小劑量 14 35.25±3.67 3.19±0.45絡必通中劑量 13 33.72±4.39 3.55±0.53絡必通大劑量/s正常組分組 樣本數(shù)/個 SNCV/(cm/s) 潛伏期15 35.22±2.83 3.49±0.43

3 絡必通顆粒對DPN大鼠糖化血紅蛋白及Na+，K+-ATP酶活性的影響

實驗動物經(jīng)肌電圖檢測時需腹腔注射氯胺酮20 mg/kg麻醉，肌電圖檢測結束后，死亡14只，最終樣本數(shù)見表5，6。模型組大鼠HbA1C較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各治療組均可降低HbA1C;絡必通大劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。模型組大鼠Na+，K+－ATP酶活性比正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各治療組均可延緩Na+，K+－ATP酶活性的降低，絡必通中、大劑量，陽性藥物與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(見表 5、6)

討 論

1 絡必通顆粒對血糖、糖化血紅蛋白的影響

糖尿病時，糖化血紅蛋白增多，其與氧的親和力增加，而不易釋放氧，造成局部組織細胞的長期缺氧，這是產(chǎn)生糖尿病神經(jīng)病變的病理生理基礎。此外，蛋白質的非酶糖化可涉及許多血漿和組織蛋白，導致蛋白變性，糖化蛋白的產(chǎn)生可引起神經(jīng)髓鞘和組織結構的損傷改變，減弱神經(jīng)組織的再生修復能力，髓鞘質糖化可引起神經(jīng)髓鞘分離脫失，軸索微管蛋白糖化使其傳導功能障礙，這些改變最終導致了糖尿病慢性并發(fā)癥如DPN的發(fā)生。實驗結果顯示模型組大鼠血糖顯著升高，糖化血紅蛋白含量顯著增加，應用絡必通顆粒后，對DPN大鼠的糖化血紅蛋白濃度有降低作用，與模型組比較有統(tǒng)計學差異，提示絡必通顆?？赡芡ㄟ^降低血糖的途徑，減少血糖與蛋白質之間的反應，抑制蛋白糖化后的各種病理反應，減少蛋白質的功能異常，達到治療DPN的作用。積極控制血糖是治療糖尿病及其并發(fā)癥的一項基礎措施。

表5 各組大鼠糖化血紅蛋白比較(±s)

表5 各組大鼠糖化血紅蛋白比較(±s)

分組 樣本/個 糖化血紅蛋白/(HbA1C )17 16.63±2.55模型組 10 27.11±5.24*陽性藥物組 13 25.04±4.07絡必通小劑量 13 24.14±4.68絡必通中劑量 9 23.58±5.63絡必通大劑量 13 23.29±2.25正常對照組△

表6 各組大鼠Na+，K+-ATP酶活性比較(±s)

表6 各組大鼠Na+，K+-ATP酶活性比較(±s)

分組 樣本/個 Na+，K+－ATP酶活性/(U/mg)17 55.92±13.71模型組 10 28.24±10.41*陽性藥物組 13 46.79±13.67△絡必通小劑量 13 39.02±10.99絡必通中劑量 9 47.36±14.16△絡必通大劑量 13 48.05±6.36正常對照組△

2 絡必通顆粒對神經(jīng)電生理的影響

寧光［6］對301例糖尿病患者進行神經(jīng)傳導檢查結果表明，相對臨床一般檢查，無論是運動神經(jīng)傳導速度，還是感覺神經(jīng)傳導速度，其異常率都要高于臨床一般檢查結果，可以在這些糖尿病患者中早期發(fā)現(xiàn)臨床無異常的神經(jīng)損傷，從而達到早期診斷目的。近期國外學者［7］進一步肯定了神經(jīng)傳導檢查、感覺定量測定，這兩種神經(jīng)電生理檢查方式的良好可重復性以及在DPN臨床試驗中的應用前景。因此將神經(jīng)電生理的改變作為DPN大鼠模型成立以及療效判定是目前動物實驗較經(jīng)典的指標。本試驗中具有益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀、解毒化濁功效的絡必通顆粒在所觀察的8周內可使模型大鼠已減慢的神經(jīng)傳導速度加快，提示絡必通顆粒對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)功能有明顯的改善作用。其中醫(yī)機理可能是益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀、解毒化濁法聯(lián)合運用而達氣陰得充，中焦得助，消渴得除，瘀濁邪毒得祛，經(jīng)脈得養(yǎng)而通暢，從而受損的神經(jīng)得以津血的濡養(yǎng)而功能恢復，神經(jīng)傳導速度加快，且絡必通顆粒中多種中藥均有降糖、降脂和改善多元醇通路狀態(tài)的作用，從而機體的代謝和微循環(huán)得以改善，傳導速度提高。

3 絡必通顆粒對Na+，K+-ATP活性的影響

Na+，K+－ATP酶是生物體內廣泛存在的一種極為重要的膜酶，廣泛分布于各類細胞質膜上，它與神經(jīng)肌肉興奮性和傳導性的保持，物質吸收和腺體的分泌等生理過程密切相關。Na+，K+－ATP酶活性的減小可反映出能量代謝的改變，影響到細胞能量釋放，導致細胞內外離子濃度差的減小，引起NCV減慢。在實驗性糖尿病動物中觀察到［2］，大鼠坐骨神經(jīng)Na+，K+－ATP酶活性明顯下降，表明糖尿病狀態(tài)下，動物外周神經(jīng)細胞Na+、K+的轉運和能量供應可能產(chǎn)生障礙，糖尿病時的多元醇通路增強可以通過影響肌醇和?；撬岽x，減少NO合成，引起偽缺血等多種途徑，導致神經(jīng)Na+，K+，ATP酶活性的降低。Bianchi等［8］的研究表明，在鏈脲佐菌素誘導后11周的糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中Na+，K+－ATP活性明顯降低，與本文的結果相一致。本實驗中，絡必通治療組增加Na+，K+－ATP酶的活性，且大劑量組效果明顯，顯示出具有增強神經(jīng)功能的作用。分析原因，糖代謝的改善是基礎治療，對于控制糖尿病及并發(fā)癥意義明確。微循環(huán)的改善有利于Na+，K+－ATP酶活性的恢復。同時這一作用可能還與絡必通顆粒降低神經(jīng)組織中多元醇含量，抑制醛糖還原酶活性等有關，這有待于今后的基礎實驗進一步證實。

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