張 聰， 胡 馨， 張英華， 俞佳寧， 周慶氫

(1.上海市中藥研究所，上海201401;2.上海市藥材有限公司，上海200002)

西紅花為鳶尾科植物番紅花(Crocus sativus L.)的干燥柱頭，主產(chǎn)于西班牙、希臘、法國(guó)及中亞西亞一帶，我國(guó)上海、浙江、江蘇等地栽培。西紅花性平，味甘，歸心、肝經(jīng)。能活血化瘀，涼血解毒，解郁安神，用于經(jīng)閉癥瘕，產(chǎn)后瘀阻，溫毒發(fā)斑，憂郁痞悶，驚悸發(fā)狂［1］。

近紅外分光光度法［2］系通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在近紅外譜區(qū)的特征光譜，并利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法提取相關(guān)信息后，對(duì)被測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種分析技術(shù)［3］。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便，分析迅速，實(shí)時(shí)反映被測(cè)對(duì)象狀態(tài);同時(shí)具有不破壞樣品，不需對(duì)樣品作任何預(yù)處理直接進(jìn)行測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)。

本論文采用便攜式近紅外光譜儀對(duì)西紅花進(jìn)行測(cè)定，建立了藥材粉末中西紅花苷-I的NIR測(cè)定模型，并用于未知樣本中西紅花苷-I含量的測(cè)定［4］。本研究為西紅花藥材大規(guī)模種植的現(xiàn)場(chǎng)采摘、加工過(guò)程控制等提供了快速檢測(cè)方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 樣品

西紅花由上海市藥材公司提供(產(chǎn)地上海崇明)，本研究采用的兩個(gè)批號(hào)樣本20091025(編號(hào)01～12)和20091120(編號(hào)01～11)分別為兩個(gè)不同采集時(shí)間所獲取的樣品，其中編號(hào)代表不同的收集地塊樣品。西紅花苷-I對(duì)照品(批號(hào):111588-200501)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與試藥

島津LC-10A高效液相色譜，色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)美國(guó)BRIMROSE公司Luminar 5030便攜式AOTF近紅外光譜儀，InGaAs檢測(cè)器，Snap光譜采集處理軟件，The Unscrambler定量分析軟件。近紅外光譜實(shí)驗(yàn)所用的參數(shù)設(shè)置為:波長(zhǎng)范圍，1 100～2 300 nm;波長(zhǎng)增量，2 nm;掃描平均次數(shù):600。掃描模式為“Ratio mode”。

2 方法與結(jié)果

2.1 西紅花苷I的含量測(cè)定

按照中國(guó)藥典［1］方法測(cè)定，典型的西紅花高效液相色譜圖如圖1所示，23個(gè)西紅花樣品的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，西紅花樣品中西紅花苷-I的含量均大于6%，高于近紅外光譜的一般檢出限。

2.2 光譜采集

將西紅花樣品研磨成粉末(過(guò)3號(hào)篩)，根據(jù)樣品的狀態(tài)，本實(shí)驗(yàn)選用旋轉(zhuǎn)測(cè)樣系統(tǒng)進(jìn)行光譜采集，可以有效地扣除背景變化帶來(lái)的影響。

實(shí)驗(yàn)中采集到的西紅花粉末的原始光譜圖如圖2所示。從圖可以看出，樣品的光譜排列比較緊密，光譜與光譜之間的相似性較強(qiáng)。

2.3 定性分析檢測(cè)

2.3.1 樣本光譜的預(yù)處理與定性模型的建立

將建模樣品光譜經(jīng)過(guò)一階微分處理后的光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入The Unscrambler分析軟件，然后利用PCA(主成分分析)對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算建立定性分析模型。

2.3.2 定性模型驗(yàn)證

表1 藥典法測(cè)定樣品中西紅花苷-I成分的含量

圖1 西紅花苷-I對(duì)照品(A)及西紅花樣品(B)HPLC色譜圖

圖2 樣品的原始光譜圖

對(duì)以PCA主成分分析法建立的定性分析模型性能的預(yù)測(cè)，可采用樣品與模型距離圖。模型區(qū)域圖中，圓點(diǎn)所在區(qū)域?qū)儆诙ㄐ阅Ｐ蛥^(qū)域，x所在區(qū)域?qū)儆陬A(yù)測(cè)樣品著落區(qū)域，如果x在模型范圍內(nèi)，說(shuō)明被測(cè)樣品與建模樣品類型相同，在模型范圍以外，說(shuō)明被測(cè)樣品與建模樣品類型不同。對(duì)驗(yàn)證樣品進(jìn)行定性分析，結(jié)果如圖3所示，模型區(qū)域圖中x均落在模型范圍內(nèi)，說(shuō)明驗(yàn)證樣品都屬于西紅花樣品。

圖3 用PCA模型預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 定量分析檢測(cè)

2.4.1 定量模型的建立

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的光譜數(shù)據(jù)與樣品含量數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)，采用偏最小二乘法(PLS1)，交叉 －驗(yàn)證法(cross-validation)，用The Unscrambler定量分析軟件建立模型。光譜和化學(xué)值異常值(outlier)分別采用光譜影響值Leverage和化學(xué)值誤差Residual這兩個(gè)統(tǒng)計(jì)量來(lái)檢驗(yàn)剔除。經(jīng)過(guò)異常值的剔除進(jìn)行逐步優(yōu)化，最后得到了較為理想的校正模型(見(jiàn)圖4)。

圖4 西紅花苷I指標(biāo)的PLS1回歸模型

從圖4可以看出，近紅外光譜與西紅花苷I成分含量間呈現(xiàn)出明顯的線性關(guān)系，其中西紅花苷I指標(biāo)的相關(guān)性為0.953 7。說(shuō)明樣品具有明顯的近紅外活性，能夠產(chǎn)生明顯的近紅外吸收，所以指標(biāo)含量和光譜圖之間有呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.4.2 模型內(nèi)部驗(yàn)證

使用建立好的PLS1模型對(duì)所有參與建模的21個(gè)樣品進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如表2所示。

表2 21個(gè)建模樣品驗(yàn)證結(jié)果(n=3)

2.4.3 模型外部驗(yàn)證

利用建立好的校正模型對(duì)2個(gè)外部樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如表3所示。從表3可以看出苷I指標(biāo)的模型預(yù)測(cè)2個(gè)外部樣品的絕對(duì)偏差分別為－0.35與0.32，相對(duì)偏差分別為5.33與3.91，這充分說(shuō)明校正模型能夠?qū)悠愤M(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)。

表3 2個(gè)驗(yàn)證樣品驗(yàn)證結(jié)果

2.4.4 方法的重復(fù)性

重復(fù)掃描某樣品10次，將得到近紅外數(shù)據(jù)帶入校正模型中進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明，10次測(cè)量得到的西紅花苷I的平均含量為8.94% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01，說(shuō)明建立的西紅花中西紅花苷I的近紅外快速測(cè)定方法精密度良好。

3 討論

利用近紅外光譜數(shù)據(jù)和校正模型能夠有效測(cè)定西紅花粉末中西紅花苷I的含量。

建模樣品的選擇應(yīng)具有代表性，同時(shí)要保證實(shí)驗(yàn)所得原始數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。隨著用于建模的樣品數(shù)增多，未知樣品的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度還會(huì)不斷得以提高。

本試驗(yàn)所建立的西紅花中西紅花苷I的近紅外測(cè)定方法，具有操作簡(jiǎn)便，分析速度快，無(wú)樣品破壞，無(wú)需其他試劑成本等特點(diǎn)，為名貴藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制提供了快速有效的方法。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2010:120.

［2］谷筱玉，徐可欣，汪 曣.波長(zhǎng)選擇算法在近紅外光譜法中藥有效成分測(cè)量中的應(yīng)用［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2006，26(9):1618-1620.

［3］朱 斌，鄭清明，秦路平，等.20種金絲桃屬植物的近紅外漫反射光譜法鑒別［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(4):455-456.

［4］蔣受軍，劉麗娜，朱 斌，等.近紅外光譜法測(cè)定注射用丹參(凍干)中丹參素、原兒茶醛及總酚含量的初步研究［J］.藥物分析，2008，28(7):1094-1098.