李 媛， 單鳴秋， 張 麗， 丁安偉，2*， 季克勝

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046;2.江蘇省方劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210046;3.江蘇省南通精華制藥有限公司，江蘇南通226005)

肺舒通是治療慢性阻塞性肺病的的臨床經(jīng)驗(yàn)方，也是由《太平惠民和劑局方》中三拗湯加味而得［1］。肺舒通噴霧劑是由金蕎麥、丹參、苦杏仁、麻黃、甘草五味中藥制成的復(fù)方制劑，方中君藥金蕎麥解毒清肺以祛外邪，臣藥丹參活血化瘀以通肺絡(luò)，具有解毒化瘀，宣肺平喘的功效，臨床用于外邪侵?jǐn)_、痰瘀阻肺的慢性阻塞性肺病，為了控制肺舒通噴霧劑的質(zhì)量，保證臨床療效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法分別測定(-)-表兒茶素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B含量，對制劑中3種成分分別進(jìn)行定量分析。該方法分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確，可達(dá)到較好的控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-10A型高效液相色譜儀(SPD-10A型檢測器)，Sartorius BP211D電子天平(精確度為十萬分之一)，RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮華生化儀器公司)。

1.2 藥品與試劑 (-)-表兒茶素(中國藥品生物制品檢定所，110878-200102)，丹參酮ⅡA對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110766-200518)，丹酚酸B對照品(中國藥品生物制品檢定所，111562-200807)，聚酰胺(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠，20070123)，乙腈、甲醇均為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。肺舒通噴霧劑(批號為200901、200902、200903，自制)。

2 方法學(xué)考察

2.1 色譜條件

(-)-表兒茶素:Symmetry shield RP C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相為0.05%三氟乙酸水溶液-乙腈(9 ∶1)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為10 μL。在此色譜條件下，(-)-表兒茶素與其它成分分離良好。見圖 1、2。

圖1 (-)-表兒茶素對照品HPLC色譜圖

圖2 (-)-表兒茶素供試品HPLC色譜圖

丹參酮ⅡA［2］:Symmetry shield RP C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相(A)∶甲醇-水(75∶25);檢測波長:270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:35℃，進(jìn)樣量:10 μL。在此色譜條件下，丹參酮ⅡA與其它成分分離良好。見圖3、4。

圖3 丹參酮ⅡA對照品HPLC色譜圖

圖4 丹參酮ⅡA供試品HPLC色譜圖

丹酚酸 B［2］:Symmetry shield RP C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相(B):甲醇-乙腈-水-甲酸(30∶10∶59∶1);檢測波長:286 nm;流速:0.8 mL/min;柱溫:35 ℃，進(jìn)樣量:10 μL。在此色譜條件下，丹酚酸B與其它成分分離良好。見圖5、6。

圖5 丹酚酸B對照品HPLC色譜圖

圖6 丹酚酸B供試品HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取(-)-表兒茶素對照品2.79 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密稱取丹參酮ⅡA對照品2.05 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密稱取丹酚酸B對照品5.02 mg，置10 mL棕色量瓶中，加流動相(B)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取本品0.5 mL，置5 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。經(jīng)聚酰胺(10 mL濕體積)純化，50 mL水洗脫，棄去水洗液，95%乙醇60 mL洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，揮去乙醇，用乙腈-0.05%三氟乙酸水溶液水(1∶9)洗凈殘?jiān)?，? mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得(-)-表兒茶素供試品溶液。

精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加流動相(A)稀釋至刻度，搖勻。從中吸取1 mL，置5 mL量瓶中，加流動相(A)稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得丹參酮ⅡA供試品溶液。

精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加流動相(B)稀釋至刻度，搖勻。從中吸取1 mL，置10 mL量瓶中，加流動相(B)稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得丹酚酸B供試品溶液。

2.4 陰性供試品液的制備

取以處方比例及制備工藝制得不含金蕎麥和丹參的樣品，按2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備，即得陰性供試品溶液。結(jié)果表明，陰性供試品溶液對(-)-表兒茶素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B的測定無干擾。見圖7～9。

圖7 (-)-表兒茶素陰性供試品HPLC色譜圖

圖8 丹參酮ⅡA陰性供試品HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系的考察

精密量取(-)-表兒茶素對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得27.900 0 μg/mL對照品溶液，采用逐級稀釋法配成13.950 0、6.975 0、3.487 5、1.743 8 μg/mL一系列濃度的對照品溶液。

圖9 丹酚酸B陰性供試品HPLC色譜圖

精密量取丹參酮ⅡA對照品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得8.200 0 μg/mL對照品溶液，采用逐級稀釋法配成4.100 0、2.050 0、1.025 0、0.512 5 μg/mL 一系列濃度的對照品溶液。

精密量取丹酚酸B對照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，加流動相(B)溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得100.400 μg/mL對照品溶液，采用逐級稀釋法配成50.200、25.100、12.550、6.275 μg/mL 一系列濃度的對照品溶液。

在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣10 μL，每個濃度進(jìn)2針，記錄峰面積。以平均峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品溶液濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(-)-表兒茶素回歸方程為 Y=13 081.4X－1 360.2(r=0.999 9)，丹參酮ⅡA回歸方程為Y=53 975X+4 658.7(r=0.999 8)，丹酚酸B回歸方程為Y=16 917X－36 766.4(r=0.999 8)。結(jié)果表明(-)-表兒茶素在 1.743 8 ～27.900 0 μg/mL、丹參酮ⅡA在 0.512 5～8.200 0 μg/mL、丹酚酸 B 在6.275～100.400 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取(-)-表兒茶素對照品溶液(濃度為13.950 0 μg/mL)、丹參酮ⅡA對照品溶液(濃度為 4.100 0 μg/mL)和丹酚酸 B(濃度為50.200 μg/mL)，分別連續(xù)進(jìn)樣 6 次，每次 10 μL，記錄峰面積。(-)-表兒茶素峰面積平均值為180 237(RSD=2.91%);丹參酮ⅡA峰面積平均值為39 046.2(RSD=2.49%);丹酚酸B峰面積平均值為825 144.8(RSD=0.90%)。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為200901本品6份，按2.3項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備，照上述色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。以平均峰面積按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得(-)-表兒茶素、丹參酮ⅡA和丹酚酸B的平均含量分別為193.2 μg/mL(RSD=0.51%)、202.7 μg/mL(RSD=1.12%)和5 604.8 μg/mL(RSD=0.16%)。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)中第1份溶液，照上述色譜條件分別進(jìn)樣 10 μL，在 0、1、2、4、6、8 h測定，記錄峰面積，(-)-表兒茶素峰面積平均值為254 691(RSD=0.84%)，丹參酮ⅡA峰面積平均值為232 185(RSD=2.68%)，丹酚酸B峰面積平均值為1 001 606(RSD=1.46%)。結(jié)果表明，供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.4 加樣回收率試驗(yàn) 取批號為200901本品，精密量取6份，每份0.25 mL，分別精密加入(-)-表兒茶素對照品溶液(6.975 0 μg/mL)0.25 mL，置5 mL量瓶中，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備。每份進(jìn)樣兩次，每次10 μL，記錄峰面積，以平均峰面積按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算平均加樣回收率。見表1。

表1 (-)-表兒茶素加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

取批號為200901本品，精密量取6份，每份0.5 mL，丹參酮ⅡA和丹酚酸B對照品溶液(2.050 0 μg/mL和 50.200 μg/mL)0.5 mL，置 50 mL 量瓶中，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備。每份進(jìn)樣兩次，每次10 μL，記錄峰面積，以平均峰面積按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算平均加樣回收率。見表2、3。

表2 丹參酮ⅡA加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 丹酚酸B加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 樣品含量測定 取3個批號的樣品，依2.3項(xiàng)供試品溶液制備方法分別制得供試品溶液。按2.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，以平均峰面積按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

金蕎麥為肺舒通噴霧劑君藥，主要含有(-)-表兒茶素［3］等黃烷醇類代表化合物，丹參為方中臣藥，水溶性部分主要為酚性酸類化合物［4］包括丹參素、原兒茶醛、丹酚酸等，主要含有丹酚酸B［5］酚酸類及丹參酮類化合物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合2005版中國藥典一部相關(guān)要求，以金蕎麥主要有效成分(-)-表兒茶素和丹參的主要有效成分丹參酮ⅡA和丹酚酸B作為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，從而更好更全面地控制肺舒通噴霧劑的質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)在初期進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)及條件篩選時，曾考慮采用梯度洗脫結(jié)合DAD檢測器同時測定此3種成分，但是由于三者之間化學(xué)性質(zhì)和含量差異較大，而且前處理方法各有差異，遂采用目前分別測定含量的方法。

［1］袁飛龍，張 麗，丁安偉.中藥復(fù)方治療慢性阻塞性肺病的研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2008，17(16):15-17.

［2］中國藥典［S］.一部.2005:52-53.

［3］鄭瑞霞，楊峻山.黃烷醇類化合物及其藥理活性［J］.國外醫(yī)藥·植物藥分冊，2005，20(2):58-61.

［4］付辛芳，劉曉紅.丹參的藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國藥師，2006，15(1):76-77.

［5］賈 娜，項(xiàng)海芝，楊松松.丹參水溶性部分丹酚酸的進(jìn)展述評［J］. 遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，8(3):41-42.