王 立， 趙 瑛

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150076;2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076)

葛根芩連湯為張仲景名方，該方由葛根、黃連、黃芩和炙甘草組成，其中甘草具有一定的解毒、抗病毒、抗?jié)兊茸饔?，其主要成分為甘草酸、甘草次酸等?］。中藥提取工藝的差異往往導(dǎo)致其制劑臨床療效差別很大。由于甘草酸胃腸道給藥后在血液中很難檢測到［2，3］，因此，本實驗通過測定灌服葛根芩連湯全方及單方煎液的家犬體內(nèi)甘草次酸體內(nèi)經(jīng)時過程，分析相應(yīng)的藥動學(xué)參數(shù)，探討煎煮方式對甘草次酸家犬體內(nèi)藥動學(xué)的影響，以期對生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Dinex高效液相色譜儀(P680泵，ASI-100自動進樣器，TCC-100柱溫箱，UVD-340U二極管陣列檢測，Chromeleon色譜工作站);XKG6-A型快速混合器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);TGL-16G型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥品與試劑

甘草次酸對照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號:A0038)，卡馬西平(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物化學(xué)教研室提供)，乙腈(色譜純)，其他試劑為分析純。葛根，黃芩，黃連，炙甘草(哈爾濱人和藥店)。

1.3 樣品制備

葛根芩連湯煎劑(T):按處方配比取葛根芩連湯各味藥的飲片(葛根15 g，黃芩9 g，黃連9 g，炙甘草6 g)5份，加水2 000 mL，先煎葛根20 min，余藥共煎30min，煎2次，合并煎液，定容1 000 mL，濃縮至200 mL，備用。

甘草單煎液(S):取炙甘草飲片30 g，加水2 000 mL，投入藥材煎30 min，煎2次，合并煎液定容至1 000 mL濃縮至200 mL，備用。

1.4 實驗動物

健康家犬12只，♀♂不限，體重(14±2.3)kg，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:UltimateTM C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫:30℃;流動相:乙腈-體積分數(shù)為0.5%冰醋酸水溶液(42:58，V/V);流速:1.0 mL/min;檢測波長254 nm。

2.2 方法專屬性考察

在本實驗所采用的色譜條件下，甘草次酸的保留時間在6.2 min左右，內(nèi)標卡馬西平的保留時間在3.7 min左右，峰形良好，血清中其他成分干擾測定，具有較高的特異性，相關(guān)色譜圖見圖1。

圖1 家犬血清中GA的HPLC圖A.空白血清 B.空白血清中甘草次酸和內(nèi)標 C.家犬灌服甘草單煎液后血清樣品圖 D.家犬灌服T后血清樣品圖 1.卡馬西平2.甘草次酸Fig.1 HPLC Chromatograms of GA in serumA.blank serum B.blank serum spiked with GA and internal standard C.serum sample after administration of decoction S to dogs D.serum sample after administration of decoction T to dogs 1.carbamazepine 2.glycyrrhetinic acid

2.3 血樣采集

12只家犬隨機分為兩組，每組各6只，給藥前12 h禁食過夜，于次日早晨空腹分別插管灌胃給予T及S溶液200 mL(相當于甘草原藥30 g)。于服藥前和服藥后 1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、36 h 分別于股靜脈取血5 mL，置塑料離心試管中離心分離血清置于－25℃冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血樣處理［4，5］

取1.5 mL血清置具塞玻璃離心試管中，加入內(nèi)標液20 μL渦旋混合2 min;加入5 mL氯仿渦旋混合5 min，3 500 r/min離心10 min，取有機層4 mL置試管中50℃水浴條件下氮氣吹干。殘渣以200 μL流動相溶解，15 000 r/min離心10 min，取上清液20 μL進樣。

2.5 標準曲線制備

精密稱取甘草次酸對照品10.0 mg至10 mL量瓶中，以溶劑H(乙腈:水=8:2，V/V)定容至刻度，得貯備液。貯備液以溶劑H分別稀釋得質(zhì)量濃度為7.5、15、30、60、120 和240 μg/mL 系列工作液，分別取上述工作液10 μL于離心試管中加入家犬血清1.5 mL蝸旋混合2 min后加入內(nèi)標液20 μL渦旋混合2 min;得濃度分別為 50、100、200、400、800 和1 600 ng/mL的含藥血清，按“2.4”項下處理、測定，以峰面積比A對質(zhì)量濃度C(ng/mL)作加權(quán)線性回歸(W=1/C2)，得方程為:A=0.012 C+0.027，r=0.999 5，血漿中甘草次酸濃度在范圍50～1 600 ng/mL間與峰面積比線性關(guān)系良好，最低定量濃度為50 ng/mL。

2.6 精密度實驗

配制低、中、高 3種質(zhì)量濃度(100、400、1 500 ng/mL)的標準血樣，相同方法處理后進樣，由標準曲線計算出質(zhì)量濃度，計算日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見表1。

表1 甘草次酸日內(nèi)與日間精密度(n=5)Tab.1 Inter-day and intra-day precision of GA in dog serum

2.7 回收率實驗

配制低、中、高 3種質(zhì)量濃度(100、400、1 500 ng/mL)的標準血樣，按“2.4”項處理后進樣，同時以相應(yīng)濃度對照品溶液直接進樣，將兩組峰面積進行比較計算絕對回收率，低、中、高濃度的絕對回收率分別為(85.3±4.5)%、(84.6±3.9)%和(84.2±3.4)%(n=6)。內(nèi)標絕對回收率為(74.2±3.7)%(n=18)。

2.8 藥-時曲線

兩組家犬灌服T、S溶液后，甘草次酸平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

2.9 藥動學(xué)參數(shù)

家犬灌服葛根芩連湯煎劑和甘草單煎液后，藥動學(xué)參數(shù)采用非隔室模型處理，Cmax和tmax以實測值表示，以末端相若干點血藥濃度的對數(shù)值對時間進行回歸，求得末端消除速率常數(shù)λZ及消除半衰期t1/2;運用梯形面積法計算藥-時曲線下面積AUC0～t;AUC0～∞=AUC0～t+Ct/λZ。計算結(jié)果見表 2。

圖2 家犬灌服T、S溶液后甘草次酸的平均藥時曲線Fig.2 Mean serum concentration-time curve of GA after administration of decoction T and S to dogs

表2 甘草次酸家犬體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)(n=6，±s)Tab.2 Parameters of GA in dogs after administration of decoction T and S(n=6，±s)

表2 甘草次酸家犬體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)(n=6，±s)Tab.2 Parameters of GA in dogs after administration of decoction T and S(n=6，±s)

參數(shù) 單位 甘草單煎液 葛根芩連湯λZ h－1 13 214±6 327 6 589±1 450 0.097±0.022 0.047±0.014 Cmax ng·mL－1 986.5±116.9 244.8±56.1 tmax h 10.3±1.5 9.7±1.5 t1/2 h 7.4±1.6 15.8±4.3 MRT0-36 h 16.7±1.7 28.3±4.8 MAT0-36 h 2.7±0.9 5.3±0.8 AUC0-36 ng·(h·mL－1)14 483±2 410 4 766±963 AUC0-∞ ng·(h·mL－1)

3 討論

體內(nèi)樣品分析中，樣品的處理是一個關(guān)鍵步驟，其好壞直接影響后續(xù)實驗的進行。由于涉及到后續(xù)實驗，因此，在參考相關(guān)文獻［4-6］的基礎(chǔ)上，選擇血清為分析樣品，采用有機溶劑萃取的方法，處理甘草次酸血清樣品。實驗結(jié)果表明，本實驗所采用的方法可靠，適用于甘草次酸家犬體內(nèi)藥物動力學(xué)實驗。

家犬灌胃服用葛根芩連湯和甘草單煎液后，其體內(nèi)甘草次酸藥物動力學(xué)參數(shù)有明顯差別，服用T與S相比，甘草次酸的消除半衰期明顯延長;配伍后甘草次酸在家犬體內(nèi)AUC降低，而達峰時間沒有明顯差異;這說明配伍后，甘草次酸家犬體內(nèi)入血量降低，清除速率減慢，而方中其他組分的存在并不影響其在體內(nèi)的達峰時間。至于出現(xiàn)這一結(jié)果的原因是方中哪一種成分的單獨作用還是哪幾種成分的協(xié)同影響以及如何影響，將在后續(xù)實驗中分別詳細考察。

［1］田圣志，賴寶林，施鈞翰，等.甘草解毒作用研究進展［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，3(9):560.

［2］Raggi MA，Maffei F，Bugamelli F，et al.Bioavailability of glycyrrhizin and licorice extract in rat and human plasma as detected by a HPLC method［J］.Pharmazie，1994，49(4):269.

［3］Shibata N，ShimokawaT，Jiang Z，et al.Characteristics of intestinal absorption and disposition of glycyrrhizin in mice［J］.Biopharm Drug Disposit，2000，21(3):95.

［4］田 娟，周彥彬，左 英，等.HPLC-MS-MS測定血漿中的甘草次酸及生物利用度［J］.中南藥學(xué)，2007，5(5):476.

［5］趙文靜，王本杰，魏春敏，等.高效液相色譜-質(zhì)譜法測定人血漿中甘草次酸濃度及人體藥代動力學(xué)研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008，46(11):1111.

［6］陸 洋，李 娟，杜守穎，等.甘草次酸在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的RP-HPLC 研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(11):1294.