白梅榮， 圖 雅， 巴根那， 包曉華

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)，蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028041)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，病因不明，嚴(yán)重危害著人類的身體健康［1－3］。至今尚無理想的抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物，開發(fā)標(biāo)本兼治、安全有效的藥物有著重要的實(shí)際價(jià)值。蒙藥復(fù)方那如－3丸，又稱那如蘇木珠爾，處方出自《至高要方》，是蒙醫(yī)臨床治療黃水病的首選方劑。由訶子、制草烏、蓽茇配伍組成。味澀辛，性溫，具有祛黃水、殺“黏”、消腫、止痛功能，主治關(guān)節(jié)痛、黃水病、蟲病、白喉、炭疽等粘性疾病及腰腿疼痛等［4］，臨床效果可佳。本研究就觀察那如－3對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠模型的治療作用，并探討了其可能的作用機(jī)制，為將那如－3開發(fā)為治療RA的有效藥物提供理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑和藥品 弗氏完全佐劑(批號(hào)122k8945)，sigma公司產(chǎn)品，由北京拜爾迪公司提供。

雷公藤片(批號(hào)040705):三九黃石制藥廠產(chǎn)品。

那如－3丸(批號(hào)20060113)，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室制備。

SOD(批號(hào) 20080221)、MDA(批號(hào) 20080113)、NO(批號(hào) 20080310)、IL－1β(批號(hào) 20080203)、TNF－a(批號(hào)20080126)、PGE(批號(hào)20080312)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠75只，體重為(180±10)g，♀♂兼用;清潔級(jí)昆明種小鼠75只，體重為(20±2)g，♀♂兼用。由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2003－00160

2 方法及結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠佐劑致繼發(fā)性足腫脹的影響 取大鼠75只，♀♂兼用，按體重隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型組、那如－3丸大劑量組、那如－3丸小劑量組、雷公藤片組，每組15只。建立模型前用容積法測(cè)量各組大鼠左右足容積。除正常對(duì)照組外，給各組大鼠右后足足跖皮內(nèi)注射Freunds完全佐劑0.1 mL致炎。第5天同量再加強(qiáng)注射1次。致炎后第15天開始，各給藥組灌胃相應(yīng)藥的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液，正常對(duì)照組和模型組灌胃0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，給藥體積均為2 mL/100 g。每日1次，一直給到第26天。同時(shí)觀察記錄致炎后第12天、15天、18天、21天和24天各組大鼠右后足跖腫脹度，在第1次致炎后第26天依次進(jìn)行如下處理:

(1)斷頭取血，在37℃保溫30 min，再置4℃冰箱40 min，(2 000 r/min離心10 min，取血清，轉(zhuǎn)移至2 mL具塞塑料離心管中，置超低溫冰箱(－45℃)中，備用于測(cè)定血清SOD和MDA;

(2)取其右后足關(guān)節(jié)上1 cm以下部位，剪碎后放入盛有5 mL生理鹽水的具塞離心管中，過夜。離心，取上清液，轉(zhuǎn)移至5 mL具塞塑料離心管中，置超低溫冰箱(－45℃)中，備用于測(cè)定關(guān)節(jié)組織中IL－1β、TNF－a、PGE 和 NO、SOD、MDA 含量。按照試劑盒說明嚴(yán)格操作，在放射免疫測(cè)定儀上測(cè)定IL－1β和TNF－a的含量;PGE2按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行測(cè)定;在紫外－可見分光光度儀上測(cè)定NO含量。結(jié)果見表1～4。

2.2 對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 佐劑致大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎大鼠第一次致炎后第26天斷頭取血、取關(guān)節(jié)后，每組隨機(jī)抽取12只大鼠，無菌操作，打開腹腔取出脾臟，制備大鼠脾細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板，200 μL/孔，使終濃度為 5 ×106/mL，細(xì)胞懸液數(shù)，每個(gè)供試品分裝6個(gè)孔，其中3孔為對(duì)照組不加ConA，另3孔加入 ConA(5 mg/mL)，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，溫育44 h后，每孔加入 MTT(5 mg/mL)繼續(xù)溫育4 h，終止培養(yǎng)，離心(1 500 r/min)5 min，棄去上清液，晾干后加入0.04 mo1/L鹽酸異丙醇100 μL，充分混勻，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm下的吸光度(A值)，以A值表示細(xì)胞的增殖反應(yīng)能力。結(jié)果見表5。

2.3 結(jié)果

2.3.1 對(duì)大鼠佐劑致繼發(fā)性足腫脹的影響 模型組大鼠足容積自致炎第15天起有明顯的腫脹，一直到第24天與正常對(duì)照組比較均有顯著差異，其中第18天時(shí)達(dá)高峰。說明佐劑引起的繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎模型建立成功。各給藥組也有不同的腫脹，但第15天至第24天的足容積與模型組比較，明顯下降，有顯著差異(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

2.3.2 對(duì)大鼠關(guān)節(jié)組織中白芥素－1β和腫瘤壞死因子－a的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組關(guān)節(jié)組織 IL－1β、TNF－a含量明顯升高(P ＜0.01)。與模型組相比，那如－3大、小劑量組和雷公藤片組關(guān)節(jié)組織 IL－1β、TNF－a 含量均明顯下降(P ＜ 0.05、P ＜0.01)。結(jié)果見表2。

2.3.3 對(duì)大鼠關(guān)節(jié)組織中前列腺素和一氧化氮的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組關(guān)節(jié)組織PGE、NO含量明顯升高(P＜0.01)。與模型組相比，那如－3丸大、小劑量組和雷公藤片組關(guān)節(jié)組織PGE、NO含量均明顯下降(P＜0.05、P＜0.01)。結(jié)果見表3。

2.3.4 對(duì)大鼠足關(guān)節(jié)中超氧化物歧化酶和丙二醛的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組血清SOD、MDA含量無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與模型組相比，那如－3丸大、小劑量組和雷公藤片組血清SOD、MDA含量無明顯變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果見表4。

表1 那如-3丸對(duì)大鼠佐劑致繼發(fā)性足腫脹的影響(±s，n=15)

表1 那如-3丸對(duì)大鼠佐劑致繼發(fā)性足腫脹的影響(±s，n=15)

與模型組比較*P＜0.05。

組別 劑量/(g/kg·d)致炎后不同時(shí)間足腫脹率/%12 d 15 d 18 d 21 d 24 d正常對(duì)照組模型組那如－3丸大劑量組那如－3丸小劑量組雷公藤片組－－0.4 0.8 0.52 1.33±0.15 1.40±0.11 1.38±0.11 1.37±0.14 1.39±0.13 1.35±0.15*1.53±0.09 1.45±0.10*1.43±0.14*1.46±0.10*1.37±0.15*1.60±0.09 1.51±0.10*1.51±0.13*1.53±0.09*1.39±0.14*1.57±0.10 1.45±0.09*1.45±0.08*1.47±0.09*1.40±0.14*1.56±0.10 1.45±0.09*1.45±0.08*1.47±0.10*

表2 那如-3丸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足關(guān)節(jié)中IL-1β、TNF-a的影響(±s，n=14)

表2 那如-3丸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足關(guān)節(jié)中IL-1β、TNF-a的影響(±s，n=14)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量/(g/kg·d) 樣本數(shù)/只 IL－1β含量/(ng/mL) TNF－a含量/(ng/mL)正常對(duì)照組 － 14 0.148±0.056** 1.128±0.704**模型組 － 14 0.268±0.172 3.450±1.201那如－3丸大劑量組 0.4 14 0.140±0.043** 2.325±1.097**那如－3丸小劑量組 0.8 14 0.139±0.050** 2.126±1.375**雷公藤片 0.52 14 0.174±0.097** 2.573±2.165*

表3 那如-3丸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足關(guān)節(jié)中PGE、NO的影響(±s，n=14)

表3 那如-3丸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足關(guān)節(jié)中PGE、NO的影響(±s，n=14)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

NO正常對(duì)照組 － 14 0.181±0.063** 14.80±11.87組別 劑量/(g/kg·d) 樣本數(shù)/只 PGE2**模型組 － 14 0.442±0.089 40.90±24.68那如－3丸大劑量組 0.4 14 0.347±0.055** 21.39±12.68**那如－3丸小劑量組 0.8 14 0.335±0.043** 17.47±10.20**雷公藤片 0.52 14 0.355±0.068** 24.53±9.258*

表4 那如-3丸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足關(guān)節(jié)中SOD、MDA的影響(±s，n=14)

表4 那如-3丸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足關(guān)節(jié)中SOD、MDA的影響(±s，n=14)

組別 劑量/(g/kg·d) 樣本數(shù)/只 SOD/(U/mL) MDA/(nmol/mL)正常對(duì)照組 －14 79.27±37.33 3.494±1.340模型組 － 14 69.21±47.89 3.346±0.965那如－3丸大劑量組 0.4 14 72.18±35.38 3.450±0.687那如－3丸小劑量組 0.8 14 63.12±37.04 2.885±0.612雷公藤片0.52 14 78.16±40.03 4.129±0.511

2.3.5 對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力有所提高，差異顯著(P＜0.01)。與模型組相比，各給藥組對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖有抵抗作用，差異顯著(P＜0.05)。見表5。

3 討論

AA是一種免疫性炎癥模型，該模型繼發(fā)性病變表現(xiàn)為以多發(fā)性關(guān)節(jié)炎為特征的全身遲發(fā)性超敏反應(yīng)［5］。為探討那如－3丸對(duì)大鼠AA的治療作用，于繼發(fā)性反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)開始灌胃給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，劑量為0.4、0.8 g/(kg·d)，能夠明顯抑制繼發(fā)性足腫脹，對(duì)大鼠AA有明顯改善作用。

RA是一種全身性異質(zhì)性自身免疫性疾病，研究表明在RA發(fā)病過程中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)，即促炎細(xì)胞因子(如IL－l、IL－6、TNF－a)和抗炎細(xì)胞因子(如 IL－10)的不平衡占有重要地位［6－8］。PGE2可以參與炎癥反應(yīng);SOD的活性和MDA的水平與脂質(zhì)過氧化、炎癥等機(jī)體多種狀況有關(guān)。因此，測(cè)定以上指標(biāo)對(duì)抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥效機(jī)制的研究和闡明具有一定作用［9－11］。

表5 那如-3丸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s，n=15)

表5 那如-3丸對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(±s，n=15)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

吸光度值正常對(duì)照組 － 12 0.091±0.059組別 劑量/(g/kg·d)樣本數(shù)/只**模型組 － 12 0.240±0.070那如－3丸大劑量組 0.4 12 0.123±0.045*那如－3丸小劑量組 0.8 12 0.108±0.053*雷公藤片 0.52 12 0.115±0.026*

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AA組大鼠經(jīng)弗氏完全佐劑刺激后，產(chǎn)生的 IL－l、TNF－a水平明顯升高，阻抑由它們介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥(降低PGE2和NO含量)，降低關(guān)節(jié)腫脹度(P＜0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的AA大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)，而不同劑量的那如－3可以明顯下調(diào)AA大鼠升高的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。

綜上所述，那如－3丸對(duì)AA大鼠具有明顯的治療作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)機(jī)體異常的免疫功能和維持細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡有關(guān)。此結(jié)果為將那如－3丸開發(fā)為治療人類RA的新藥提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Verhoeven A C，Boers M，Tugwell，Combination therapy in rhenmatoid arthritis:updated systematic review［J］.Br J Rheumatol，1998，37(6):612－619.

［2］鮑春德.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的現(xiàn)狀及展望［J］.上海醫(yī)學(xué)，2003，26(7):449.

［3］郭中琦，李俊蘭.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中醫(yī)藥治療進(jìn)展［J］.臨床薈萃，2001，16(13):622.

［4］白清云.中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書(蒙醫(yī)學(xué))［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1992:250.

［5］Theisen－Popp P，Miiller－Peddinghaus R.Antirheumatic drug profiles evaluated in the adjuvant arthritis of rats by multiparameter analysis［J］.Agents Actions，1994，42(1):50－55.

［6］楊德森，劉 芳，曾繁典，等.青藤堿對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎治療作用及機(jī)制的研究［［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30(17):1361.

［7］王曉東，鄧治文，彭曉華，等.藏藥然降多吉膠囊對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2004，29(12):1186.

［8］周學(xué)平，周玲玲，宋耀鴻，等.清絡(luò)通痹顆粒對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥細(xì)胞因子的影響［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2003，19(8):54－50.

［9］張厚利，齊 艷，楊 彤，等.痹癥停合劑對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的防治作用及其機(jī)制研究［J］.中成藥，2004，26(1):85.

［10］姚余有，江禮生.黃芪總黃酮對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及機(jī)理研究［J］.中成藥，2001，23(9):661.

［11］谷曉紅.膽通痹湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26(S):39.