王福剛， 高允生， 齊永秀， 劉 斌， 王 偉

(1.泰山醫(yī)學院 藥學院，山東泰安271016;2.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京100102)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛，活血通經，清心除煩之功效?，F(xiàn)代藥理學研究證明，丹參具有增加冠狀動脈血流量、調節(jié)血脂、抑制血栓形成和改善微循環(huán)等作用［1－2］。白花丹參Salvia miltiorrhiza f.Alba是丹參的變型，它主要分布在山東章丘、萊蕪等地的山區(qū)地帶。白花丹參除具有丹參的作用和用途外，對治療血栓閉塞性脈管炎具有獨特療效，臨床應用前景十分廣闊［3］。近年來關于白花丹參化學、藥理等方面的研究很多，為進一步綜合開發(fā)利用白花丹參，本實驗采用高效液相色譜法對白花丹參藥材指紋圖譜進行了研究，可為其鑒別、質量評價以及質量標準制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀，2996 DAD檢測器;Sartorious BT 25S型1/100000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);KQ－500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 丹參酮ⅡA(批號:110766－200417)、丹酚酸 B(批號:111562－200504)、丹參素鈉 (批號:110855－200405)、丹參酮Ⅰ(批號:0867－200502)均購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇(Sigma公司，色譜純);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司出品);其他試劑均為分析純。

1.3 供試藥材 白花丹參藥材:其中S1、S3、S4于2006年10月采自山東泰安，S2、S5、S8于2006年11月采自山東萊蕪，S6、S7、S9、S10于2007年10月采自泰安，經泰山醫(yī)學院藥學院中藥學教研室高紅莉副教授鑒定為唇形科植物白花丹參Salvia miltiorrhiza flalba.Alba的干燥根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);采用梯度洗脫;流動相:甲醇(A)－0.1%三氟乙酸水溶液(B)，洗脫劑A在0～5 min為10%，在5～15 min由10%增至40%，在15～50 min由40%增至70%，在50～70 min由70%增至100%，在70～80 min為100%。流速:1.0 mL/min;檢測波長:270 nm;分析時間:75 min。

2.2 供試品溶液的制備 取白花丹參藥材10 g，萬能高速粉碎機粉碎，均過40目篩。取粉末約1 g，精密稱定，置具有冷凝回流裝置的圓底燒瓶中，精密加入50 mL水，稱定重量，煎煮30 min，放冷，再稱定重量，用水補足減失重量。再向燒瓶中精密加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，稱定重量，用50%的甲醇補足減失的重量，6 000 r/min離心10 min，取上層溶液過0.45 μm微孔濾膜，用于HPLC進樣分析。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉、丹酚酸B、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA對照品適量，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取供試液，連續(xù)進樣5次，選擇各共有峰進行比較，結果表明，各共有峰相對保留時間 RSD＜1.35%，相對峰面積RSD＜2.03%，表明進樣的精密度良好。

2.4.2 重現(xiàn)性實驗 取同一批白花丹參藥材5份，按2.2項方法平行制備供試液，進行測定。結果表明，各共有峰相對保留時間RSD＜1.82%，相對峰面積RSD＜2.90%。表明其重現(xiàn)性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗 取同一批白花丹參藥材，分別于制備后 0、2、4、8、12、24 h 進樣測定。結果表明，各共有峰相對保留時間RSD＜1.43%，相對峰面積RSD＜2.32%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及技術參數(shù)

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有指紋峰的標定 按照2.1項方法操作，制備10批白花丹參供試液，通過比較10批供試品HPLC色譜圖的檢測結果，選定其中14個共有的色譜峰為共有指紋峰，建立白花丹參藥材的HPLC色譜指紋圖譜，圖1。經對照品定性，1號色譜峰鑒定為丹參素鈉，5號色譜峰為丹酚酸B，11號色譜峰為丹參酮Ⅰ，14號色譜峰為丹參酮ⅡA，見圖2。其中丹酚酸B峰面積約占總峰面積的15%，比較穩(wěn)定，因此選其為參照峰，標為S。樣品S1至S10色譜圖出峰總數(shù)依次為 36、38、27、37、38、32、37、23、29、35，共有峰面積占總峰面積的比值依次為91.41%、90.43%、96.74%、91.32%、90.83%、91.21%、90.59%、94.24%、92.27%、90.56%。

圖1 白花丹參供試品HPLC圖譜

2.5.2 共有峰的相對保留時間及相對峰面積 將各色譜峰保留時間與同一圖譜中丹酚酸B的保留時間比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間;將各色譜峰峰面積與同一圖譜中丹酚酸B的峰面積比較，其比值為各色譜峰的相對峰面積。10批樣品中各共有峰相對保留時間見表1，各共有峰相對峰面積見表2。由表1、2可知，10批樣品基本均一、穩(wěn)定。

表1 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表2 10批樣品指紋圖譜共有峰的相對峰面積

圖2 對照品HPLC圖譜

2.6 指紋圖譜相似度計算 將10批白花丹參藥材指紋圖譜數(shù)據(jù)導入中藥指紋圖譜相似度軟件2004A，計算均值相似度，結果 10批樣品相似度分別為 0.997，0.998，0.980，0.998，0.987，0.996，0.997，0.988，0.998，0.968。結果見圖3。

圖3 10批白花丹參指紋圖譜

3 討論

3.1 提取方法的選擇 通過對提取方式(超聲、熱提取)的考察，發(fā)現(xiàn)采用超聲與熱回流提取相結合的提取方式，樣品色譜圖的譜峰信號較多［4］。對不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、75%甲醇、水、先水回流后50%甲醇超聲)考察，結果表明先水回流后50%甲醇超聲色譜圖信息量最多，成分含量最高。對不同流提取時間(30、45、60 min)進行了考察，發(fā)現(xiàn)水熱回流30 min，成分數(shù)量及含量最高，實驗研究發(fā)現(xiàn)，提取時間過長，導致丹參酮類成分減少。故供試品溶液的制備方法確定為以水回流提取30 min，后50%甲醇超聲30 min。

3.2 色譜條件的選擇 本實驗中考察了甲醇－水系統(tǒng)，甲醇－0.1%冰醋酸系統(tǒng)，甲醇－0.1%三氟乙酸水溶液系統(tǒng)，乙腈－0.1%三氟乙酸水溶液系統(tǒng)。由各色譜圖比較得，甲醇－0.1%三氟乙酸溶液系統(tǒng)出峰峰形較好，基線平穩(wěn)，故選擇甲醇－0.1%三氟乙酸溶液洗脫分離。

在選定的色譜條件下，以DAD檢測器得到的三維圖譜在不同波長下切割，得到270 nm條件下出峰最多，峰形較好，特征性較強，峰的分離度較好，基線也較平穩(wěn)，故選擇270 nm作為檢測波長。

3.3 參照峰的選擇 本品主要含有脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹酚酸等成分，本文確定了丹參酮IIA(14號峰)、丹參酮I(11號峰)、丹酚酸B(5號峰)、丹參素鈉(1號峰)的色譜峰位置，經HPLC圖譜比較，丹酚酸B峰較大，為丹參的主要成分之一，且中國藥典2005年版一部丹參項下采用其含量為質量控制指標，故選擇丹酚酸B為參照峰。

3.4 指紋圖譜的評價 對采自山東泰安、萊蕪市的10批白花丹參藥材進行了指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)收集來的不同產地白花丹參指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致，相似度計算結果表明，10批樣品指紋圖譜相似度均在90%以上。不同批次的白花丹參藥材指紋圖譜的相對保留時間也有相當好的相似性。但是，比較不同產區(qū)藥材各共有峰相對保留面積有所差別，可能因為藥材生產過程中受到土壤、氣候等因素、環(huán)境因素及采收加工過程中諸多因素的影響。

色譜指紋圖譜是在研究中藥指控和質量標準過程中誕生的一種分析技術，由于色譜指紋圖譜可以提供大量的信息，而且還能提供各組分的相對含量來進行量的描述，所以它可以為中醫(yī)藥的研究提供良好的分析數(shù)據(jù)［5］。本實驗采用RP－HPLC方法，建立了白花丹參藥材的指紋圖譜。結果表明該方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好，可為白花丹參藥材質量分析、評價與控制提供依據(jù)。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:52－53.

［2］關 昕，吳立軍，解黎雯.丹參現(xiàn)代研究概況［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2005(7):445－446.

［3］李允堯，趙華英，陳滬寧，等.山東省白花丹參的植物資源［J］.中藥材，2000，23(2):69－70.

［4］劉 洋，石任兵，劉 斌，等.丹參藥材化學成分HPLC指紋圖譜研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2006，29(3):188－192.

［5］洪莜坤，王智華.中藥數(shù)字化色譜指紋圖譜［M］.上海:上?？茖W技術出版社，2003:5.