郭國寧 尚永軍 朱國宴 文 亮 向 強 （第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院急診科,重慶 400038）

共抑制分子PD-1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型免疫系統(tǒng)及滑膜組織的表達(dá)①

郭國寧 尚永軍②朱國宴③文 亮④向 強 （第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院急診科,重慶 400038）

目的:探討共抑制分子PD-1在牛二型膠原（CII）誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型（CIA）小鼠免疫器官、關(guān)節(jié)及RA患者滑膜組織內(nèi)的表達(dá)。方法:使用牛二型膠原免疫DBA-1/j小鼠,建立小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型;免疫組化檢測類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎標(biāo)本PD-1的表達(dá)變化;流式細(xì)胞分析術(shù)（FACs）檢測對PD-1陽性細(xì)胞進(jìn)行定位。結(jié)果:免疫組化的結(jié)果證實,小鼠的骨髓、胸腺、脾臟及淋巴結(jié)有中有大量的PD-1陽性細(xì)胞,FACs分析結(jié)果表明這些PD-1+細(xì)胞主要為CD3+T細(xì)胞,B220+B細(xì)胞,CD68+巨噬細(xì)胞及CD11c+樹突狀細(xì)胞,統(tǒng)計分析表明CIA小鼠體內(nèi)PD-1表達(dá)及分布相對于對照組小鼠沒有顯著提高。此外,RA患者及CIA小鼠的滑膜組織內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)少量PD-1陽性的細(xì)胞。結(jié)論:PD-1陽性細(xì)胞可能不參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程。

PD-1;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;滑膜組織;免疫器官;免疫組化

①本文受國家自然科學(xué)基金（30700855及60971117）資助

②內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科,赤峰024000

③重慶江陵醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶400038

④通訊作者

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis,RA）是以對稱性多關(guān)節(jié)滑膜炎為主要臨床癥狀的自身免疫性疾病。多數(shù)病人有永久性骨破壞,并可出現(xiàn)關(guān)節(jié)外損害,若無恰當(dāng)治療,則最終形成終生殘疾甚至危及生命[1]。

對RA關(guān)節(jié)損傷的病理研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)性活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞在RA的病程中有重要作用。而對T細(xì)胞活化機制的研究表明,T細(xì)胞的有效活化和效應(yīng)發(fā)揮需要共刺激信號,缺乏共刺激信號的抗原刺激易引起免疫耐受（Tolerance）、無反應(yīng)性（Anergy）或細(xì)胞凋亡（Apoptosis）[2]。已知的幾種共刺激分子（CD28、CTLA-4、ICOS 、PD-1、BTLA 等）在多種疾病中起主導(dǎo)作用,合理的增強或封閉這些共刺激途徑已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤、病毒和寄生蟲感染、移植排斥及自身免疫性疾病等的實驗治療并取得了良好的效果[2]。特別是,基于CTLA-4及CD40等共刺激途徑的免疫調(diào)節(jié)藥物已經(jīng)應(yīng)用于RA的臨床治療并取得了初步成效[3,4]。如K remer等[3]使用CTLA-4-Ig融合蛋白對220例處于活動期的RA患者進(jìn)行治療,發(fā)現(xiàn)CTLA-4-IgFc治療6個月后,患者關(guān)節(jié)炎癥減輕,生活質(zhì)量及關(guān)節(jié)功能均得到明顯改善,并且與CTLA-4-IgFc融合蛋白的使用劑量呈正相關(guān)。表明通過共刺激途徑來誘導(dǎo)T細(xì)胞對自身抗原的免疫耐受并應(yīng)用于RA的臨床治療是—項很有前景、值得嘗試的研究。

PD-1（Program death-1）是1999年鑒定的胞內(nèi)具有兩個免疫受體酪氨酸抑制性基序（ITIMs）共刺激分子受體,其結(jié)構(gòu)和功能類似于CTLA-4。PD-1與其配體PD-L1或PD-L2交叉聯(lián)結(jié)后可下調(diào)TCR信號并最終抑制T細(xì)胞的活化[5]。而PD-1基因敲除小鼠可自發(fā)產(chǎn)生狼瘡樣的增生性關(guān)節(jié)炎,表明該信號在維持外周耐受中有關(guān)鍵作用[6]。最近的研究表明,PD-1基因的多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān),在RA患者的關(guān)節(jié)積液內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有顯著增多的CD4+PD-1+T細(xì)胞[7-9]。此外,使用PD-L1IgGFc融合蛋白增強PD-1信號可顯著降低CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥,提示PD-1信號可調(diào)節(jié)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及進(jìn)程[10]。

雖然對PD-1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用已經(jīng)有了文獻(xiàn)報道。但是迄今對PD-1在小鼠及RA患者體內(nèi)尤其是滑膜組織內(nèi)的分布尚未知。本研究主要對比分析PD-1在CIA小鼠及正常對照小鼠骨髓、胸腺、脾臟及淋巴結(jié)表達(dá)變化,分析PD-1在滑膜組織內(nèi)的分布情況,為進(jìn)一步闡明PD-1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程中的作用提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織:4例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的標(biāo)本取自西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科。患者經(jīng)生化指標(biāo)檢測、抗風(fēng)濕因子抗體滴度及滑膜組織H&E染色都證實為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。所有的手術(shù)患者在術(shù)前3個月內(nèi)都未接受任何激素治療。標(biāo)本使用4%甲醛固定,脫水后使用石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型小鼠的建立 6周齡大小的雄性DBA-1/j小鼠購自上海中國科學(xué)院實驗動物中心并飼養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。CIA模型的建立及評價如文獻(xiàn)[11]報道。簡單介紹如下:100μg牛二型膠原溶解于100μl的醋酸并使用完全佛氏佐劑充分乳化。選擇小鼠的尾根部多點注射。21天后在相同的位置再次使用相同劑量增強免疫。小鼠接受相同體積（100μl）的PBS注射作為對照。

為了評價關(guān)節(jié)炎癥程度,所有的小鼠每3天觀察一次。連續(xù)觀察40天。小鼠的關(guān)節(jié)炎癥臨床評分按如下標(biāo)準(zhǔn)劃分:0.所有的關(guān)節(jié)無任何腫脹或變紅;1.部分關(guān)節(jié)變紅但不腫脹;2.多數(shù)關(guān)節(jié)腫脹及變紅;3.關(guān)節(jié)及指頭都腫脹及變紅;4.關(guān)節(jié)僵硬或畸形強直[12]。

取經(jīng)40天CII膠原免疫誘導(dǎo)的CIA模型（關(guān)節(jié)炎評分=4,n=5）及PBS對照（n=5）小鼠骨髓、胸腺、脾臟、腋下淋巴結(jié)組織。4%多聚甲醛固定并脫水后石蠟包埋。

1.2.2 PD-1表達(dá)的免疫組化 RA患者的滑膜組織及小鼠（PBS處理對照組及CIA模型）的免疫器官組織制成3～5μm的切片。免疫組化按常規(guī)方法進(jìn)行。即切片經(jīng)脫蠟及復(fù)水后,使用0.01 mol/L的枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。待冷卻后使用0.03%H2O2處理30分鐘去掉內(nèi)源性過氧化物酶活性。0.01%磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5分鐘,3次后使用0.01%牛血清白蛋白（BSA）封閉30分鐘,隨即滴加山羊抗小鼠PD-1多抗（10μg/m l,該抗體也與人PD-1有交叉反應(yīng),R&D System）,4℃條件下過夜孵育。次日滴加EnVision+TM（EnVisionTM System,HRP,mouse/rabbit,Dako）二抗并于室溫孵育 70分鐘。同時以山羊的IgG1作為同型對照。最后使用DAB對標(biāo)本進(jìn)行顯色,顯微鏡下控制顯色時間,使用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,水洗,脫水,透明后中性樹膠封片。

為了對比分析PD-1陽性細(xì)胞在PBS及CIA小鼠各器官內(nèi)的表達(dá)變化,骨髓、淋巴結(jié)及胸腺各切片隋機選擇5個區(qū)域（放大倍數(shù)×600,0.018mm2/區(qū)域）進(jìn)行照相。而脾臟切片則僅僅選擇白髓區(qū)域進(jìn)行照相。陽性細(xì)胞使用Pro-Plus 5.0軟件進(jìn)行計算。

1.2.3 PD-1表達(dá)的流式分析 使用流式細(xì)胞儀分析PD-1在CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B220+B細(xì)胞及CD11c+樹突狀細(xì)胞的分布。實驗步驟如下:骨髓,胸腺,脾臟及淋巴結(jié)組織制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞隨即加入 PE-PD-1、FITC-CD4、FITC-CD8、FITC-B220、FITC-CD11c抗體并室溫孵育30分鐘。隨后10 000細(xì)胞/樣進(jìn)行上機檢測。實驗結(jié)果使用CellQuest軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用t檢測對PD-1陽性細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎及對照小鼠各器官的表達(dá)變化進(jìn)行對比分析。P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 CIA模型的建立 PBS對照組小鼠后爪關(guān)節(jié)正常,而DBA-1/j小鼠在經(jīng)牛Ⅱ型膠原免疫40天后,腳趾包括趾骨關(guān)節(jié),掌骨關(guān)節(jié),近端和遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)都出現(xiàn)明顯的腫脹。此外,H&E染色顯示CIA模型小鼠有大量炎細(xì)胞浸潤并出現(xiàn)滑膜增生,骨破壞及血管翳的形成（圖1）,表明DBA-1/j小鼠在經(jīng)牛Ⅱ型膠原免疫40天后可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。

圖1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型的建立Fig.1 H istological analysis in the joint of hind limbs during CIA

圖2 免疫組化分析PD-1在PBS及CIA小鼠各免疫器官的表達(dá)及分布Fig.2 The expression of PD-1 in the immune organs was determ ined by immunohistochem istry

圖3 FACs分析PD-1在各免疫器官內(nèi)的表達(dá)Fig.3 The phenotype of PD-1+cells in immune organswas determ ined by flow cetometry

2.2 PD-1表達(dá)分析結(jié)果 為了探討關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及進(jìn)程是否與免疫器官內(nèi)PD-1的表達(dá)變化相關(guān),我們使用免疫組化技術(shù)對CIA模型及對照組小鼠的免疫器官包括骨髓,胸腺,脾臟及掖下淋巴結(jié)的PD-1表達(dá)進(jìn)行了分析。如圖2所示,PD-1主要表達(dá)于骨髓淋巴樣細(xì)胞;而淋巴結(jié)處,PD-1陽性的細(xì)胞也主要分布于皮質(zhì)區(qū);胸腺內(nèi)PD-1陽性的細(xì)胞廣泛分布于胸腺髓質(zhì)及皮質(zhì)區(qū);而脾臟,PD-1主要表達(dá)白髓區(qū)內(nèi)淋巴樣的細(xì)胞,紅髓及白髓/紅髓連接區(qū)也有少量PD-1陽性的細(xì)胞。進(jìn)一步使用FACs對骨髓、胸腺、脾臟及淋巴結(jié)的 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞,B220+B細(xì)胞及CD11c+樹突狀細(xì)胞PD-1的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示PD-1表達(dá)于這些器官內(nèi)CD11c+樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞及T細(xì)胞。此外,在胸腺,CD4+CD8+雙陽性胸腺細(xì)胞缺乏PD-1表達(dá)（圖3）。

我們對CIA模型及對照組小鼠免疫器官內(nèi)PD-1陽性細(xì)胞的數(shù)目分別進(jìn)行了計算,統(tǒng)計分析結(jié)果表明PD-1陽性細(xì)胞的數(shù)目在兩組之間沒有顯著差異（圖4）,表明在關(guān)節(jié)炎發(fā)生及進(jìn)程中,免疫器官內(nèi)的PD-1功能狀態(tài)未發(fā)生變化。

2.3 PD-1在滑膜組織的表達(dá) 為了進(jìn)一步分析關(guān)節(jié)內(nèi)PD-1的表達(dá)情況,我們對PBS對照、CIA模型小鼠及關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織進(jìn)行免疫組化分析,如圖5所示,PBS對照及CIA模型小鼠的關(guān)節(jié)處發(fā)現(xiàn)有少量PD-1陽性的細(xì)胞。此外,人RA患者的滑膜組織也發(fā)現(xiàn)有少量的PD-1陽性細(xì)胞,表型分析其主要是樹突狀細(xì)胞。關(guān)節(jié)炎滑膜組織內(nèi)有少量的PD-1陽性細(xì)胞表明滑膜內(nèi)PD-1陽性細(xì)胞可能不參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程的調(diào)節(jié)。

圖5 PD-1在小鼠關(guān)節(jié)及RA患者滑膜組織內(nèi)的表達(dá)Fig.5 The expression and distribution of PD-1 in joints of normalm ice,rheumatoid synovium from CIAm ice aswellasRA patients

圖4 PD-1陽性細(xì)胞的數(shù)目在PBS處理組及CIA模型小鼠兩組之間的統(tǒng)計分析Fig.4 Thenumber of PD-1+cells in immune organs between PBS-treated m ice vs CIA m ice

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一種累及滑膜關(guān)節(jié)為主的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,早期以關(guān)節(jié)炎性腫脹、疼痛為主要表現(xiàn),若未進(jìn)行及時有效地治療,可逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨及骨的損傷,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形與強直,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及工作能力[1,2]。當(dāng)前,RA的臨床治療仍以非甾體抗炎藥物和慢作用抗風(fēng)濕藥物為主,糖皮質(zhì)激素也較為常用。這些藥物均有一定療效,但由于毒副反應(yīng)較人,病人難以長期服用。因此,急需新的特異性作用靶點或新的干預(yù)手段來對RA患者進(jìn)行治療。

由于共刺激信號PD-1/PD-L在維持外周耐受中有關(guān)鍵作用,因此探討該途徑在疾病中的功能是目前研究的熱點。最近的研究表明,PD-1基因的多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生相關(guān)[7,8]。雖然在RA患者的關(guān)節(jié)積液內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有顯著增多的PD-1+T細(xì)胞[9]。但是迄今對PD-1在關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi),尤其是免疫器官及滑膜組織的表達(dá)及分布況尚未未知。本研究我們系統(tǒng)分析了PD-1在關(guān)節(jié)炎模型小鼠及人滑膜組織內(nèi)的表達(dá)情況。FACs檢測結(jié)果表明在正常小鼠,PD-1主要表達(dá)于免疫器官內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞,巨噬細(xì)胞及免疫細(xì)胞如T細(xì)胞及B細(xì)胞。免疫組化分析表明,PD-1主要表達(dá)于骨髓內(nèi)淋巴樣細(xì)胞;在胸腺,PD-1陽性的細(xì)胞廣泛分布于胸腺髓質(zhì)及皮質(zhì);而在脾臟,PD-1主要表達(dá)白髓區(qū)淋巴細(xì)胞;我們也發(fā)現(xiàn)大量PD-1陽性的細(xì)胞位于淋巴結(jié)的皮質(zhì)區(qū)。此外,我們對CIA模型及對照組小鼠免疫器官內(nèi)PD-1陽性細(xì)胞的數(shù)目分別進(jìn)行了計算,統(tǒng)計分析表明PD-1陽性細(xì)胞的數(shù)目在兩組之間沒有顯著差,表明在關(guān)節(jié)炎進(jìn)程中,炎癥并沒有改變免疫器官內(nèi)PD-1的表達(dá)。

為了進(jìn)一步分析關(guān)節(jié)內(nèi)PD-1的表達(dá)情況,我們對CIA模型小鼠及關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果顯示CIA模型小鼠的關(guān)節(jié)處僅僅發(fā)現(xiàn)有少量的PD-1陽性細(xì)胞。此外,人RA患者的滑膜組織也發(fā)現(xiàn)少量的PD-1陽性細(xì)胞。關(guān)節(jié)炎滑膜組織內(nèi)沒有增多的PD-1陽性細(xì)胞浸潤表明關(guān)節(jié)及滑膜內(nèi)的PD-1信號可能沒有參類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程的調(diào)節(jié)。

總之,本研究首次分析了PD-1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎內(nèi)的表達(dá)情況,為進(jìn)一步基于通過PD-1/PD-L信號通路進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)治療提供了理論基礎(chǔ)。

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[收稿2010-07-29 修回2010-08-10]

（編輯 許四平）

Expression and distribution of the co-inhibitory molecule PD-1 in tissues from rheumatoid arthritis

GUOGuo-Ning,SHANGYong-Jun,ZHUGuo-Yan,WENLiang,XIANGQiang.DepartmentofWest-SouthHospital,the3rdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China

Objective:To detect PD-1 protein expression in immuneorgans from bovine collagenⅡ（CII）-inducedmouse rheumatoid arthritis（CIA）and synovial tissuesof RA patients.Methods:Theexpression and distributionof PD-1 antigen was analyzed by immunohistochemistry.Moreover,flow cytometry（FACs）was further used to characterize PD-1 expression.Results:Immunohistochemicalanalysis revealed that PD-1 positive cellswere found in thymus,spleen,lymph nodes and bonemarrow,and FACs further demonstrated that PD-1 positive cellswere CD3+T cells,B220+B cells,CD68+macrophages or CD11c+dendritic cells.However,the exp ression and distribution of PD-1 were not changed significantly between normaland CIAm ice.Interestingly,seldom PD-1 positive cellswere found both in synovial tissues of CIAm ice and in RA patients.Conclusion:PD-1 signalm ightnotbe involved in regu lating the pathogenesis of RA.

PD-1;Rheumatoid arthritis;Synovial tissues;Immuneorgans;Immunohistochemistry

R392.3

A

1000-484X（2010）12-1119-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.014

郭國寧（1974年-）,男,博士,主治醫(yī)師,主要從事免疫調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)及臨床研究,E-mail:gotoguoguo@126.com。