李方和 張春燕 李佩珊 李時君 陳 妍

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心,武漢 430030）

排溢法ELISA,一種改進(jìn)的二步法標(biāo)記免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)①

李方和 張春燕 李佩珊②李時君②陳 妍

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心,武漢 430030）

目的:建立一種簡便的血清HBsAg檢測二步法標(biāo)記免疫試驗(yàn)。方法:在既往G6 ELISA的基礎(chǔ)上建立血清HB-sAg檢測排溢法ELISA,采用系列稀釋實(shí)驗(yàn)對方的相對顯色強(qiáng)度,敏感性,及其對Hooks效應(yīng)的拮抗能力進(jìn)行考核,將其用于對一組臨床標(biāo)本的檢測,并與經(jīng)典二步法及一步法ELISA進(jìn)行比較。結(jié)果:在大致相同的實(shí)驗(yàn)條件下排溢法,二步法及一步法ELISA三者實(shí)驗(yàn)信號的強(qiáng)度大致相當(dāng);其敏感性分別為19.2、12.6及14.5 pg/ml。當(dāng)被檢標(biāo)本HBsAg濃度在37.5μg/ml時一步法ELISA開始顯現(xiàn)Hooks效應(yīng),至2400μg/ml時測值已接近閾值;而排溢法及經(jīng)典二步法ELISA兩者對Hooks效應(yīng)則表現(xiàn)出相似的拮抗。對231例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測,112例高滴度陽性標(biāo)本（經(jīng)稀釋實(shí)驗(yàn)證實(shí)）中出現(xiàn)中重度Hooks效應(yīng)者一步法ELISA 17例,占15.2%,而排溢法及其二步法ELISA則未見Hooks效應(yīng)的影響。結(jié)論:在保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的前提下,排溢法ELISA在操作程度簡化上與一步法相當(dāng),但可完全克服Hooks現(xiàn)象的干擾。

標(biāo)記免疫檢測技術(shù);ELISA;一步法ELISA;HBsAg;Hooks效應(yīng)

固相酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的發(fā)展迄今已超過40年,其實(shí)驗(yàn)類型繁多,反應(yīng)方式亦曾歷多次重要改進(jìn)。一步法ELISA建立于上世紀(jì)80年代初中期,于80年代后期引入我國并迅速得到推廣,其目的在于對經(jīng)典的二步法實(shí)驗(yàn)在操作上加以簡化[1,2]。作為迄今最為成功的方法學(xué)改進(jìn)之一,該法對我國臨床免疫檢測一直有著十分巨大的影響[3]。但由于未能完全克服Hooks效應(yīng)的干擾,該法不宜用作某些輸血傳播性疾病的臨床診斷與篩查[3-5]。為使臨床免疫檢測過程繼續(xù)保持“一步法”的相對簡化,我們提出利用液相分層原理,以隨后加入的標(biāo)記抗體溶液相對隔斷待測標(biāo)本中靶物質(zhì)與固相載體間接觸,從而防止Hooks效應(yīng)發(fā)生的實(shí)驗(yàn)理念,并據(jù)此建立“血清HBsAg檢測排溢法ELISA”?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 抗HBs-G6 mAb IgG（G6mAb）由本室既往研制[6];羊抗HBs-辣根過氧化物酶標(biāo)記物濃縮物（抗HBs-HRP）由鄭州安圖公司提供;高濃度HB-sAg質(zhì)控血清（衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心發(fā)布）由湖北省臨床檢驗(yàn)中心黃鵬研究員饋贈;高濃度血源性HB-sAg提取物（采用紫外比色法確定濃度）由中國科學(xué)院武漢病毒研究所嚴(yán)兵研究員提供;其它多種生物學(xué)與化學(xué)試劑等均自市售獲得。排溢法酶標(biāo)記抗體稀釋液為本室自行配制,其組成包含常規(guī)ELISA酶標(biāo)抗體稀釋液的主要成分,以及為調(diào)變該液體密度與粘度所必需的幾類低分子與高分子物質(zhì)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 待檢血清:共231份,自本院檢驗(yàn)科收集,根據(jù)檢驗(yàn)科常規(guī)檢驗(yàn)流程采集及轉(zhuǎn)運(yùn),其乙肝病原學(xué)指標(biāo)在血清收集前已由該科室檢測（乙肝五項,資料未顯示）。

1.2 方法

1.2.1 HBsAg ELISA檢測方法

1.2.1.1 排溢法ELISA 由本室建立。該法采用抗HBsG6-mAb預(yù)包被反應(yīng)板,所使用的實(shí)驗(yàn)材料與現(xiàn)行血清HBsAg檢測一步法及其二步法ELISA大致相當(dāng),酶標(biāo)記抗體的使用濃度與一步法ELISA相當(dāng),其稀釋液的配制與前兩法有顯著區(qū)別。在實(shí)驗(yàn)操作上,排溢法ELISA具有與一步法ELISA類似的簡便特征,但其免疫反應(yīng)過程與二步法ELISA同。具體操作為:①在抗HBsG6-mAb預(yù)包被反應(yīng)板各孔中分別加待檢血清,不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)血清,或陰、陽性對照標(biāo)本各100μl,37℃反應(yīng)30分鐘;②各孔加入經(jīng)特殊稀釋液配制的羊抗HBs-HRP 100μl,37℃靜置反應(yīng)30分鐘。此加液操作宜輕柔;③按常規(guī)ELISA操作洗板,加入TMB-H2O溶液顯色15分鐘,以2mol/LH2SO4終止反應(yīng),置酶標(biāo)儀上測定A450nm值,以P/N≥2.1判為陽性。

1.2.1.2 一步及二步法ELISA 亦采用抗HBsG6-mAb預(yù)包被反應(yīng)板,所使用的實(shí)驗(yàn)材料與現(xiàn)行血清HBsAg檢測一步法ELISA及其二步法ELISA相同。實(shí)驗(yàn)操作同市售試劑之一步與二步法ELISA,具體操作見本室既往報道

1.2.2 標(biāo)記抗體稀釋液的配制與特征分析

1.2.2.1 血清HBsAg檢測排溢法ELISA中所采用的酶標(biāo)稀釋液的配制根據(jù)本室既定方法,并參照既往申報的專利文本。

1.2.2.2 稀釋液密度分析 采用稱重法,具體操作按本室常規(guī)。

1.2.2.3 稀釋液粘度分析 采用旋轉(zhuǎn)法,檢測在SA-5600自動血液流變測試儀（北京賽利希德科技發(fā)展公司）上進(jìn)行。

1.2.3 方法敏感性與Hooks效應(yīng)拮抗能力 方法敏感性與Hooks效應(yīng)拮抗能力考核采用系列稀釋實(shí)驗(yàn)。方法敏感性的評價采用線性回歸法分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。其組間數(shù)據(jù)比較以P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗HBs HRP稀釋溶液的配制 參考本室既往研究資料配制排溢法ELISA所專用的酶標(biāo)記抗體溶液稀釋系統(tǒng)。采用稱重法及其旋轉(zhuǎn)法對稀釋液的密度與粘度進(jìn)行測定,兩者分別為1.035及1.450mPa.S。

2.2 排溢法ELISA的顯色強(qiáng)度 采用常規(guī)標(biāo)本稀釋液將部頒質(zhì)控血清稀釋至1.0 ng/ml濃度,采用本研究建立的排溢法ELISA對其做重復(fù)檢測,其顯色時間嚴(yán)格控制在15.0分鐘,并與一步法及二步法進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表1）顯示其顯色強(qiáng)度以一步法ELISA略高,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較三者顯色強(qiáng)度未見顯著差別。

2.3 排溢法ELISA的敏感性 采用常規(guī)標(biāo)本稀釋液（PBS,pH7.2）將部頒質(zhì)控血清稀釋至4.0 ng/m l濃度,然后按表2以相同稀釋液對其做系列稀釋。采用本研究建立的排溢法ELISA對其進(jìn)行檢測,并與一步法及二步法ELISA進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。采用線性回歸法對上述結(jié)果進(jìn)行分析,三者敏感性約分別為19.2、12.6及14.5 pg/m l。

2.4 Hooks效應(yīng)拮抗效果 采用常規(guī)標(biāo)本稀釋液將純化表面抗原稀釋至2 400.0μg/m l濃度,然后以相同稀釋液對其按表3做系列稀釋。采用本研究建立的排溢法ELISA對其進(jìn)行檢測,并與一步法及二步法進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。排溢法與二步法ELISA兩者測值均在3.0附近,而一步法ELISAA450值自37.5μg/ml孔開始逐步下降,至2 400.0μg/m l時降至接近閾值（設(shè)定閾值0.105A450）水平。

2.5 血清HBsAg臨床檢測效果 采用二步法ELISA對231份臨床血清HBsAg初篩陽性者進(jìn)行檢測,檢出112份A450＞3.00的HBsAg陽性者。采用本法對該組標(biāo)本進(jìn)行檢測,并與一步與二步ELISA進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表4）顯示排溢法檢測A450較二步法略低（A450均值分別為2.89與3.01,P＞0.05）,但全部測值均集中在A450高值組,而一步法檢測A450高值組僅95份（85.0%）,與前兩組比較有顯著性差異（P均＜0.01）。出現(xiàn)中重度Hooks效應(yīng)者17例,占15.2%。未見因Hooks效應(yīng)致HBsAg檢測陰性者。

表1 排溢法ELISA在血清HBsAg檢測中的信號強(qiáng)度及其與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方式的比較Tab.1 Signal intensity of excluded ELISA to detection ofHBsAg and compared with traditionalmethods

表2 排溢法HBsAg檢測的敏感性及其與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方式的比較Tab.2 The sensitivity of HBsAg detection by excluded ELISA and that compared with traditionalmethods

表3 排溢法ELISA HBsAg檢測對Hooks效應(yīng)的糾正及其與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方式的比較Tab.3 The correction results of Hooks effect on HBsAg detected by excluded ELISA and their comparison with traditional experimentalmethods

表4 二步法ELISA高信號標(biāo)本重復(fù)檢測結(jié)果Tab.4 The rechecked reau lts of the high signa l samples detected by tw o-step ELISA

3 討論

與其它臨床診斷技術(shù)一樣,標(biāo)記免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)亦歷經(jīng)多次革新與發(fā)展,二步法ELISA,尤其是雙抗體（或抗原）夾心ELISA是其最為成功的試驗(yàn)?zāi)Ｊ街弧２僮鞑襟E偏多是該法的主要缺點(diǎn)[3,4]。筆者長期從事臨床免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究,曾于上世紀(jì)90年代中期對洗滌強(qiáng)度與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行過較全面的比較與研究,并提出在某些實(shí)驗(yàn)步驟后可減少洗滌次數(shù),即實(shí)施所謂“亞充分洗滌”的概念（資料未報道）。受當(dāng)時實(shí)驗(yàn)材料限制及其一步法ELISA早期蓬勃發(fā)展的影響,筆者當(dāng)時的有關(guān)研究結(jié)果未能與Hooks效應(yīng)的糾正關(guān)聯(lián)。盡管從二步法衍生出的一步法ELISA能在保持檢測質(zhì)量的前提下顯著簡化實(shí)驗(yàn)操作,但這種反應(yīng)模式不能完全克服Hooks現(xiàn)象的干擾,并因而不適宜對某些表達(dá)濃度范圍過寬的特殊臨床標(biāo)志做定性與定量檢測[3-5]。在對獻(xiàn)血員的HBsAg篩選中已被停止使用[7]。這一事實(shí)使臨床免疫檢驗(yàn)相關(guān)學(xué)者倍感遺憾,同時也為既往“亞充分洗滌”操作（相當(dāng)于目前倡導(dǎo)的“一道洗滌”步驟）在新的物質(zhì)與技術(shù)條件下的臨床應(yīng)用提供了良好的契機(jī)。然而簡單省略實(shí)驗(yàn)中部分洗滌步驟,在技術(shù)創(chuàng)新上并未顯示出更為矚目的跨越,不足以形成一項新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與新的診斷產(chǎn)品。為此,筆者提出排溢法標(biāo)記免疫實(shí)驗(yàn)的概念,并在既往雙抗體夾心ELISA的基礎(chǔ)上建立了血清HBsAg檢測排溢法ELISA。

密度梯度離心是一種常見的生物學(xué)分離手段,含不同溶質(zhì)的溶液因其密度不同而在同一容器中自動上下分置的特征（現(xiàn)象）是實(shí)施該實(shí)驗(yàn)的基本前提。兩種或多種溶液在同一容器中的位置及其分層狀態(tài)的維系時間可根據(jù)各溶液的密度及其粘度的變化加以調(diào)節(jié),由此可最大限度地滿足相關(guān)實(shí)驗(yàn)的需要。這一現(xiàn)象曾在外周血有形成分（如外周血單個核細(xì)胞）的分離中得到十分廣泛地應(yīng)用,但迄今未見有報道用于標(biāo)記血清學(xué)實(shí)驗(yàn)者。

作者將這一分層現(xiàn)象引入二步法ELISA。當(dāng)包被于反應(yīng)孔下部表面的抗體與標(biāo)本中靶物質(zhì)之間的免疫反應(yīng)結(jié)束后,旋即加入經(jīng)特殊稀釋液配制的酶標(biāo)抗體（如抗HBsHRP）溶液。此酶標(biāo)抗體溶液因密度較實(shí)驗(yàn)標(biāo)本為高而平鋪于反應(yīng)孔的底部,與經(jīng)一次免疫反應(yīng)后的固相界面發(fā)生接觸,并因而獲得與被固相化的靶抗原發(fā)生免疫反應(yīng)的機(jī)會。而待檢標(biāo)本則因密度較低被排溢至標(biāo)記抗體溶液的頂端,與參與免疫反應(yīng)的固相載體脫離,并在其與標(biāo)記抗體溶液之間形成較清晰并相對持久的分層界面。這一較二步法ELISA顯著簡化的方法我們將其稱之為“排溢法ELISA”。需要注意的是簡單的排溢過程難免導(dǎo)致少量待測標(biāo)本的殘留,然而既往一步法已證實(shí)少量甚至較多靶抗原在體系中的存在并不影響標(biāo)記抗體與固相化靶抗原的免疫結(jié)合,因而采用排溢法檢測時酶標(biāo)孔孔壁少量靶抗原的殘留不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不利影響。

通常情況下,排溢法檢測所用標(biāo)記抗體溶液的密度與粘度越高,分層維持的時間越長,分層界限越清晰。然而過高的密度與粘度對標(biāo)記抗體在溶液中的彌散及其免疫結(jié)合會帶來一定程度的負(fù)面影響。為達(dá)成理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在標(biāo)記抗體稀釋液的配制過程中,我們首先全盤接受現(xiàn)行市售一步法ELISA標(biāo)記抗體的種種技術(shù)特征。其次通過加入幾種經(jīng)優(yōu)化選擇的高、低分子溶質(zhì)提升稀釋液的密度;通過改變此兩類化劑的比例（必要時加入一定量表面活性劑）調(diào)節(jié)稀釋液的粘度;在某些特殊（密度與粘度要求較高）的實(shí)驗(yàn)場合,尚需適當(dāng)延長反應(yīng)時間,或加入適量免疫活性劑以促進(jìn)標(biāo)記抗體與固相化抗原的結(jié)合。鑒于在不同實(shí)驗(yàn)體系中標(biāo)記抗體稀釋液的制備須經(jīng)歷一個較具個性化的,復(fù)雜而細(xì)致的優(yōu)化過程,其具體配制方法我們將在有關(guān)研究中作進(jìn)一步的闡述。

采用稀釋對比實(shí)驗(yàn)對所建立的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行考核,結(jié)果顯示三法顯色強(qiáng)度與敏感性相當(dāng)（表1、2）,對Hooks效應(yīng)的拮抗效果排溢法亦與二步法大致相同（表3）。采用本法對112份二步法ELISA HBsAg檢測A450大于2.5（平均2.91）的陽性者進(jìn)行檢測,并與一步ELISA進(jìn)行比較。排溢法HBsAg檢測A450較二步法略低,但全部標(biāo)本均集中在A450高值組,而一步法檢測A450高值組標(biāo)本僅95例（85.0%）,顯著低于排溢法與二步法檢測組（P＜0.01）。

綜合評價上述三者,一步法ELISA以操作簡便為主要特征,但因存在Hooks效應(yīng)的干擾而不宜用于部分特殊指標(biāo)的臨床檢測;二步法ELISA操作步驟偏多,但技術(shù)成熟度高且基本不受Hooks效應(yīng)的干擾;排溢法與一步法ELISA相比操作強(qiáng)度相似,操作過程略有區(qū)別。即待檢標(biāo)本與標(biāo)記抗體的加入由同步改為不同步,免疫反應(yīng)由三者同步（一步法ELISA）改為固相抗體與靶抗原,以及間接固相化抗原與標(biāo)記抗體等兩步序貫（即二步免疫反應(yīng)）進(jìn)行。這一改變并未增加實(shí)驗(yàn)操作,但較一步法多一次免疫反應(yīng)時間。與經(jīng)典的二步法ELISA相比,排溢法可省去靶抗原反應(yīng)后的標(biāo)本移出,以及移出后反應(yīng)板的一道（通常為3～5次）洗滌過程,操作步驟得到明顯地簡化,而對Hooks效應(yīng)的拮抗能力則與之相同。由此可以認(rèn)定排溢法ELISA在部分特殊臨床標(biāo)志檢測的實(shí)用價值顯然高于前兩種方法。

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[收稿2010-05-27 修回2010-09-07]

（編輯 張曉舟）

Development of excluded ELISA and its application in the detection of HBsAg in sera w ith hepatitis B virus infection

LIFang-He,ZHANGChun-Yan,LIPei-Shan,CHENYan,LIShi-Jun.ExperimentalMedicineCenter,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

Objective:To estab lish a simple two-step labeled immune test to detect the serum HBsAg.Methods:The excluded ELISA was established based on the previousG6 ELISA for serum HBsAg detection,and its relative colorstrength,sensitivity,and the antagonistic capacity to the Hooks effectwere assessed using serial dilutions test.The assay was used to detect a group of clinical specimens,and the results were comparedwith thoseof the classic two-step and one-step ELISA.Results:The test signal strengthof Excluded ELISAwasrough ly the same of the other twomethod,two-step and one-step ELISA in similar experimental conditions.The sensitivitywas19.2 pg/m l,12.6 pg/mland 14.5 pg/ml,respectively.When HBsAg concentration of the sampleswas up to37.5μg/ml,one-step ELISA began to show the Hooks effect,and themeasured valueswere close to the threshold value when HBsAg up to 2 400μg/ml;But the excluded ELISA and the classical two-step ELISA both were showed similar antagonistic to the Hooks effect.By useof the threemethods to detect231 clinical samples,the results showed that therewere 17 sam pleswithmoderate to severe Hooks effectswhen detected by one-step ELISA,acconunting for 15.2%in 112 samples with high-titerpositive samples（confirmed by dilution experiments）,whereas there was no Hooks effect detected by the other twomethods.Conclusion:In the premise of guaranteed results,the excluded ELISA is equal to the one-step ELISA in the degree of simplification of operation,but it could comp letely overcome the interference of Hooks effect.

Labeled immunoassay technique;ELISA;one-step ELISA;HBsAg;Hooks effect

R392.7

A

1000-484X（2010）12-1110-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.012

①本文為科技部“國家2008年科技重大專項課題:艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治專項”課題（No.2008ZX10205）

②現(xiàn)在中國醫(yī)藥集團(tuán)武漢生物制品研究所工作,武漢430060

李方和（1950年-）,男,主任技師,主要從事免疫學(xué)技術(shù)研究,E-mail:fhli@tjh.tjmu.edu.cn。