張榮偉 田阿勇 禹紅梅 陳 蕾 （中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病干診科,沈陽 110001）

輔助性T細(xì)胞亞群在小鼠EAE模型視神經(jīng)中的變化①

張榮偉 田阿勇②禹紅梅③陳 蕾④（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病干診科,沈陽 110001）

目的:探討輔助性T細(xì)胞亞群Th1、Th2、Th17及Treg在小鼠EAE模型視神經(jīng)炎發(fā)病機(jī)制中的意義。方法:C57BL/6小鼠隨機(jī)分為佐劑對(duì)照組（n=16）、EAE模型組（n=48）,免疫后第11、15、19天分批處死小鼠,觀察視神經(jīng)組織的病理改變。ELISA方法檢測視神經(jīng)IFN-γ、IL-4、IL-17的蛋白含量;Real-time PCR方法檢測視神經(jīng)組織IFN-γ、IL-4、IL-17和Foxp3的基因表達(dá)。結(jié)果:免疫后第11天IL-17的蛋白及mRNA的表達(dá)比正常對(duì)照組明顯增高（14.255±0.790 vs 10.615±0.664;0.798±0.137 vs 0.083±0.013,均P＜0.05）,免疫后第19天IFN-γ的蛋白及mRNA的表達(dá)比對(duì)照組明顯增高（21.060±1.821 vs 12.845±0.970;0.617±0.070 vs 0.089±0.014,均P＜0.05）,IL-4的蛋白及mRNA的表達(dá)與對(duì)照組比較減少（10.227±0.767 vs 14.258±0.885;0.089±0.014 vs 0.250±0.047,均P＜0.05）。Foxp3mRNA的表達(dá)由免疫后11天、15天至19天與對(duì)照組比較均明顯減少（1.068±0.121,0.495±0.064,0.605±0.021 vs 3.087±0.194,P＜0.01）。結(jié)論:EAE小鼠視神經(jīng)Foxp3和Treg表達(dá)減少可能為視神經(jīng)炎發(fā)生發(fā)展的重要因素;IL-17在EAE小鼠視神經(jīng)炎的早期階段介導(dǎo)炎癥損傷,IFN-γ在發(fā)病的高峰期加重了EAE小鼠視神經(jīng)的炎癥損傷。

EAE;視神經(jīng);白介素17;干擾素γ、白介素4;叉頭蛋白3

①本文為遼寧省教育廳資助項(xiàng)目（2009A733）

②中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科,沈陽110001

③中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,沈陽110001

④中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科,沈陽110001

視神經(jīng)炎（Optic neuritis,ON）是累及視神經(jīng)的急 性或亞急性炎癥,是神經(jīng)眼科臨床最常見的疾病之一,西方國家文獻(xiàn)報(bào)道原發(fā)性或特發(fā)性脫髓鞘性視神經(jīng)炎（Idiopathic demyelinatingoptic neuritis,IDON）是臨床最為常見的類型,該類型的視神經(jīng)炎和多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis,MS）的發(fā)病密切相關(guān),二者有共同的病理改變[1,2]。流行病學(xué)研究表明70%的MS病人存在視神經(jīng)炎,10%～20%的MS病人臨床首發(fā)癥狀為視神經(jīng)炎,而且具有很高的轉(zhuǎn)化為MS的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。對(duì)視神經(jīng)炎的早期識(shí)別與干預(yù)具有重要意義。從現(xiàn)有資料看,國內(nèi)外脫髓鞘性視神經(jīng)炎的分子免疫學(xué)研究并不多見,CD4+T輔助細(xì)胞（Th）是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,根據(jù)其分泌的細(xì)胞因子不同,分為Th1、Th2細(xì)胞亞型,Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子,具有促炎癥反應(yīng)作用;Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子,具有抗炎作用[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)一類不同于Th1和Th2的細(xì)胞亞群,它們不表達(dá)IL-4或IFN-γ,卻高水平分泌IL-17,被命名為Th17細(xì)胞,Th17細(xì)胞被證實(shí)能通過分泌炎癥介質(zhì)IL-17誘導(dǎo)嚴(yán)重的自身免疫反應(yīng)[7]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+regulatory T cell,Treg）,約占外周CD4+T細(xì)胞的5%～10%,具有很強(qiáng)的免疫抑制能力[8]。叉頭蛋白3（forkhead/winged helix transcription factorp3,Foxp3）是FOX蛋白家族成員之一,主要表達(dá)于CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,是Treg的特異性標(biāo)志,調(diào)節(jié) Treg發(fā)育和發(fā)揮功能的重要開關(guān)[9]。在EAE/MS發(fā)病機(jī)制的研究中,以往學(xué)者們更關(guān)注于腦與脊髓的病變,而缺乏對(duì)視神經(jīng)病變的研究,尤其對(duì)輔助性T細(xì)胞亞群在小鼠EAE模型視神經(jīng)中的變化報(bào)道很少。本研究通過ELISA、熒光定量PCR技術(shù)檢測Th1、Th2、Th17細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17以及Foxp3在視神經(jīng)組織的蛋白及基因表達(dá),旨在探討小鼠EAE模型視神經(jīng)的免疫環(huán)境變化,研究輔助性T細(xì)胞亞群Th1、Th2、Th17和Treg在發(fā)病機(jī)制中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 健康6～8周齡的雌性野生型C57BL/6小鼠（SPF15）共 64只,體重16～18克,購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SOXK（滬）2007-0005;MOG35-55多肽MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK由西安美聯(lián)多肽合成有限公司合成,合成純度HPLC＞99%;結(jié)核桿菌凍干粉、百日咳菌液（北京生物制品研究所）;完全弗氏佐劑（Sigma公司）;細(xì)胞因子ELISA試劑盒（北京博奧森公司）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）;Real time PCR試劑盒（TaKaRa公司）;H-600型透射電鏡（日本）;Olympus BX51熒光顯微鏡（日本Olympus公司）;ABI 7500 PCR儀（美國ABI公司）;

1.2 方法 動(dòng)物購進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)2周,隨機(jī)分為佐劑對(duì)照組（簡稱C）,模型組（簡稱M）,其中模型組又分為免疫后11天、免疫后15天和免疫后19天3個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別簡稱M11、M 15、M19,每組16只動(dòng)物。

1.2.1 EAE模型制備 取MOG35-55 10 mg溶于2.5ml生理鹽水,取TB 17.5mg溶于2.5m l CFA（TB 1mg/m l）,充分乳化制備抗原乳劑（MOG 200μg/m l,TB 4mg/ml）。二組小鼠分別于背部脊柱中線兩側(cè)各選二個(gè)進(jìn)針點(diǎn)皮下注射相應(yīng)抗原,0.2 m l/只,以生理鹽水為對(duì)照,記免疫當(dāng)天為0天,第0、2天予模型組腹腔注射百日咳菌液0.1ml（含百日咳桿菌109個(gè)）,對(duì)照組予等量生理鹽水。免疫后第7天以相同抗原乳劑重復(fù)免疫。

1.2.2 行為學(xué)觀察 小鼠經(jīng)MOG免疫后,每日由觀察者按EAE癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠進(jìn)行功能評(píng)分,直至MOG免疫后19天。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[11]:0分:無任何臨床癥狀;1分:尾部張力消失,可見輕度步態(tài)笨拙;2分:雙后肢無力,被動(dòng)翻身后可以恢復(fù);3分:雙后肢癱瘓,被動(dòng)翻身后不能恢復(fù),但給予刺激后可以挪動(dòng);4分:雙后肢癱瘓,前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁;5分:瀕死狀態(tài)或死亡。癥狀介于兩者標(biāo)準(zhǔn)之間者以±0.5計(jì)。

1.2.3 標(biāo)本收集及形態(tài)學(xué)觀察 分別于免疫后11天、15天、19天分批處死各組小鼠,快取雙側(cè)視神經(jīng),低溫勻漿后取上清,用于ELISA檢測;2.5%戊二醛固定后,常規(guī)方法制備電鏡切片;預(yù)冷PBS清洗后,置于DEPC處理過的凍存管中,投入液氮罐,4小時(shí)后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 IL-17、IL-4、IFN-γ細(xì)胞因子的ELISA 檢測采用ELISA雙抗體夾心ABC法,加入酶標(biāo)板檢測。檢測程序按照試劑盒說明書進(jìn)行。洗板后加入TBM顯色,置反應(yīng)板于酶標(biāo)儀上讀取OD值,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出小鼠視神經(jīng)組織中IL-17、IFN-γ、IL-4蛋白的含量。

1.2.5 PCR實(shí)驗(yàn) （1）RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):采用Trizol法抽提各組視神經(jīng)總RNA,將經(jīng)過稀釋后的RNA樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系如下:5×Buffer 2 μl,RTEnzymeMix Ⅰ 0.5 μl,OligodT（50Um）0.5μl,Total RNA（1 μg/μl）1.0,Random 6mers（100Um）0.5 μl,RNase Free dH2O up to 20μl,反應(yīng)條件:37℃15分鐘,85℃5秒。（2）Real-time PCR:引物委托TaKaRa公司合成（見表1）,按照說明書用蒸餾水配成0.2 μmol/L濃度,將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系如下:SYBR-green（2×）10μl,PCR Forward Primer（10 Um）0.4 μl,PCR Reverse Primer（10 Um）0.4 μl,ROX Reference DyeII（50×）0.4μl,預(yù)變性95℃10秒檢測關(guān);變性95℃5秒檢測關(guān);退火 60℃34秒檢測關(guān);延伸72℃45秒檢測開;變性、退火和延伸重復(fù)45個(gè)循環(huán)。以標(biāo)準(zhǔn)品梯度的測量結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以計(jì)算各樣品所測基因的含量,各樣品目的基因的含量除以其管家基因的含量,即得到樣品校正后的基因相對(duì)含量。實(shí)驗(yàn)引物見表1。

表1 各細(xì)胞因子基因的引物序列Tab.1 Cytokine prem ier sets for Real-time PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件包統(tǒng)計(jì),計(jì)量資料用±s,采用雙尾t檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 EAE小鼠行為學(xué)變化 免疫后14天左右,小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙,評(píng)分開始上升,發(fā)病后表現(xiàn)為慢性進(jìn)展型,臨床神經(jīng)功能評(píng)分見圖1。

2.2 視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu) 電鏡所見正常視神經(jīng)纖維較細(xì),髓鞘密度較為均勻（圖2A）。免疫后第11天,少部分有髓神經(jīng)軸索破壞,個(gè)別軸索內(nèi)線粒體輕度腫脹;髓鞘不規(guī)則扭曲,板層結(jié)構(gòu)消失（圖2B）。免疫后第15天,大部分有髓神經(jīng)軸索破壞,神經(jīng)纖維髓鞘明顯水腫,不規(guī)則增厚或板層狀結(jié)構(gòu)排列疏松（圖2C）。免疫后第19天,絕大多數(shù)視神經(jīng)均有較明顯的病變,表現(xiàn)為不同程度脫髓鞘:髓鞘板層狀分離、剝脫,軸突軸膜與髓鞘間有間隙形成,軸突髓鞘部分向內(nèi)向外突起,或板層分離范圍擴(kuò)大,夾雜著髓鞘半環(huán)形套疊、軸索水腫,電子密度低,細(xì)胞器消失,軸突呈空泡樣和均質(zhì)狀,微管消失,甚至可見髓鞘塌陷（圖2D）。

2.3 EAE小鼠視神經(jīng)IL-17、IL-4、IFN-γ蛋白含量的變化 IL-17蛋白含量檢測顯示:與對(duì)照組比較,M11組含量明顯增加（P＜0.05）,M 15組含量仍有增加（P＜0.01）,M 19組與對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05）;IFN-γ蛋白含量檢測顯示:與對(duì)照組比較,M 15組含量增加（P＜0.01）,M19組顯著增加（P＜0.01）,M11組與對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05）;IL-4蛋白含量檢測顯示:與對(duì)照組比較,M 19組減少（P＜0.01）,M 11、M 15組蛋白含量無明顯變化（P＞0.05）。細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)趨勢如圖3所示。

圖1 EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分變化Fig.1 The clinical score of EAE mice

圖2 EAE小鼠視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultra structure in the optic nerve of EAE m ice

圖3 EAE小鼠視神經(jīng)IL-17、IFN-γ、IL-4蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of IL-17,IFN-γ,IL-4 proteins in the optic nerve of EAEm ice

圖4 細(xì)胞因子及其轉(zhuǎn)錄因子Real-time PCR的融解曲線Fig.4 Melt curve of IL-17,IFN-γ,IL-4 and Foxp3 mRNA of Real-time PCR

圖5 EAE 小鼠視神經(jīng) IL-17、IFN-γ、IL-4、Foxp3mRNA的時(shí)程表達(dá)Fig.5 Expression of IL-17,IFN-γ,IL-4,Foxp3 mRNA in the optic nerve

2.4 IL-17、Foxp3、IL-4 、IFN-γmRNA 在 EAE 小鼠視神經(jīng)的表達(dá) 結(jié)果如圖4所示,融解曲線呈單峰,說明PCR反應(yīng)特異性很好,生成單一產(chǎn)物。細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)與其蛋白的表達(dá)規(guī)律一致,與對(duì)照組比較,M11組、M 15組視神經(jīng)IL-17 mRNA的表達(dá)增加（分別P＜0.01,P＜0.05）,M19組表達(dá)逐漸下降（P＞0.05）;M15組視神經(jīng)IFN-γmRNA表達(dá)增多,（P＜0.05）,M 19組表達(dá)最明顯（P＜0.01）;Foxp3 mRNA在 M11、M15、M19組表達(dá)均明顯減少（P＜0.01）;IL-4mRNA在M 19組表達(dá)下降,與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)趨勢如圖5所示。

3 討論

多年來關(guān)于視神經(jīng)炎的發(fā)病機(jī)制缺乏深入系統(tǒng)的研究,原發(fā)性或IDON是臨床最為常見的類型,該類型的視神經(jīng)炎和MS的發(fā)病密切相關(guān),二者有共同的病理改變。在眾多有關(guān)MS的發(fā)病機(jī)制的學(xué)說中,具有更為充分的證據(jù)且廣為多數(shù)學(xué)者接受的理論是T淋巴細(xì)胞（Th0細(xì)胞）向致炎性的Th1細(xì)胞類型分化,致使Th1和Th2細(xì)胞（抗炎性Th細(xì)胞類型）平衡失調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致一系列炎癥細(xì)胞因子和化學(xué)因子釋放,從而引發(fā)中樞炎癥[12-13]。然而近來研究發(fā)現(xiàn)一種主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的具有較強(qiáng)致炎性的細(xì)胞因子IL-17能啟動(dòng)和刺激多種細(xì)胞產(chǎn)生多種致炎性細(xì)胞因子和化學(xué)因子等,導(dǎo)致炎癥產(chǎn)生[14-16]。缺失Th17細(xì)胞能防止或減輕自身免疫性腦脊髓炎（EAE）等自身免疫病的發(fā)病[17]。此外,研究表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持外周免疫耐受中起重要作用,其數(shù)量減少或功能缺失可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。然而目前對(duì)于不同的輔助性T細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子在EAE小鼠視神經(jīng)的表達(dá)規(guī)律缺乏深入系統(tǒng)的研究,本文對(duì)此作一初步探討,對(duì)于發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)及有效的干預(yù)具有重要意義。

本研究對(duì)上述CD4+T輔助細(xì)胞特異性細(xì)胞因子的蛋白及mRNA表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)小鼠致敏早期,即發(fā)病前出現(xiàn)IL-17的轉(zhuǎn)錄及翻譯高峰,開始發(fā)病后明顯下降,而IFN-γ在發(fā)病前表達(dá)較少,開始發(fā)病時(shí)表達(dá)增加,發(fā)病高峰時(shí)表達(dá)明顯增加,研究結(jié)果提示Th17細(xì)胞在EAE小鼠早期視神經(jīng)炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用,而Th1細(xì)胞在延長或促進(jìn)后期組織炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮主導(dǎo)作用。與Korn等[18]的研究結(jié)果類似,他們對(duì)EAE小鼠局部組織檢測到的炎癥介質(zhì)的動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn),IL-17出現(xiàn)高峰的時(shí)間早于IFN-γ,而且IFN-γ在IL-17消失后仍維持了很長的時(shí)間。IFN-γ的分泌滯后于IL-17的分泌提示Th1及Th17的分化表達(dá)具有階段性。

本文對(duì)Treg及Th2細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn),在小鼠致敏早期,即發(fā)病前出現(xiàn)Foxp3 mRNA表達(dá)的減少,且持續(xù)至發(fā)病的高峰期,而IL-4 mRNA表達(dá)只在發(fā)病高峰時(shí)出現(xiàn)輕微的減少,提示二者可能在疾病的不同時(shí)期發(fā)揮作用。Venken等[19]在一項(xiàng)對(duì)復(fù)發(fā)-緩解型多發(fā)性硬化和繼發(fā)進(jìn)展型多發(fā)性硬化患者的研究中發(fā)現(xiàn):兩組患者的CD4+CD25+T細(xì)胞均沒有明顯的數(shù)量和表型異常,繼發(fā)進(jìn)展型多發(fā)性硬化患者CD4+CD25+T細(xì)胞上Foxp3表達(dá)水平和對(duì)INF-γ產(chǎn)生的抑制功能也是正常的,而RR-MS患者CD4+CD25+T細(xì)胞Foxp3表達(dá)減少,對(duì)CD4+CD25+T細(xì)胞增殖和INF-γ產(chǎn)生的抑制功能下降。證明了CD4+CD25+T細(xì)胞的抑制活性與疾病持續(xù)時(shí)間的關(guān)聯(lián)性,CD4+CD25+T細(xì)胞的功能在疾病早期更易受影響。研究證明Foxp3 mRNA與Treg細(xì)胞的表達(dá)頻率一致[20,21],因此本研究通過對(duì)Foxp3mRNA檢測,結(jié)果提示Treg在EAE小鼠視神經(jīng)的早期分化或功能受到抑制。

總之,Foxp3和Treg表達(dá)減少,其抑制功能下降,使 Th17、Th1、Th2 細(xì)胞的分化和增殖異常 ,表現(xiàn)為視神經(jīng)Th細(xì)胞在發(fā)病的早期階段優(yōu)先向Th17亞群分化,在發(fā)病的高峰期優(yōu)先向Th1亞群分化,分泌大量的 IL-17、IFN-γ、TNF-α等促炎細(xì)胞因子,而具有抗炎作用的Th2類細(xì)胞因子IL-4的基因表達(dá)量在發(fā)病的早期階段無明顯變化,在發(fā)病高峰期則出現(xiàn)輕微的減少,致使促炎和抗炎力量失衡,這是EAE小鼠視神經(jīng)炎發(fā)生發(fā)展的重要因素。檢測病程不同階段IL-17、IFN-γ、Foxp3基因表達(dá)將可能作為該病的臨床診斷手段,而應(yīng)用藥物或其他手段調(diào)節(jié)Th17/Treg、Th1/Th2亞群保持平衡,抑制促炎細(xì)胞因子分泌,將對(duì)該病的臨床防治具有重要作用。

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[收稿2010-06-25 修回2010-09-08]

（編輯 倪 鵬）

Alteration of T helper cell subsets in the optic nerve of experimental autoimmune encephalomyelitis

ZHANGRong-Wei,TIANA-Yong,YUHong-Mei,CHENLei.DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalof ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China

Objective:To detect protein and gene expression of interleukin-17（IL-17）,interferon-gamma（IFN-γ）,interleukin-4（IL-4）and forkhead/winged helix transcription factor p3（Foxp3）in optic nerve and further to explore the role of T helper cell subsets such as Th1,Th2,Th17,Treg in the pathogenesis of optic neuritis of experimentalautoimmune encephalomyelitis（EAE）.Methods:Mice in C57BL/6 background were randomly divided into control group and EAE group,at the day 11,15 and 19 post-immunization,optic nerveswere dissected for morphological study,to detect IL-17,IFN-γ,IL-4.Protein analysiswas done by Enzyme-linked immunosorbentassay（ELISA）.Quantitative realtime polymerase chain reaction（PCR）was used formeasuring the gene expression of IL-17,IFN-γ,IL-4 and Foxp3.Results:The concentrations of IL-17 protein in theoptic nervewere significantup-regulated at11 days post-immunization,and sowere IFN-γprotein concentrations in 19 days.Concentrations of IL-4 protein in the optic nerve declinesslightly in19 days（P＜0.05,respectively）.ThemRNA expression of IL-17,IFN-γand IL-4 was consistentwith their protein expression（P＜0.05,respectively）.Foxp3 mRNA transcription was down-regulated from 11 days to 19 days post-immunization（P＜0.01,respectively）.Conclusion:Decreased expression of Foxp3mRNA and Treg in optic nervemay p lay a key role in developmentof optic neuritis.IL-17maymediate inflammatory pathogenicity at the early stage of optic neuritis,and IFN-γ may aggravate inflammatory injury during the peak stage of optic neuritis.

EAE;Optic nerve;IL-17;IFN-γ;IL-4;Foxp3

R741

A

1000-484X（2010）12-1101-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.010

張榮偉（1971年-）,女,博士,副教授,主要從事神經(jīng)免疫方面的研究,E-mail:zhangrongwei916@sina.com。