周英武 彭桂英 顧立剛 殷勝駿

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治病毒性疾病教育部重點實驗室,北京 100029）

利用生物芯片技術(shù)檢測人參皂苷Rg1對小鼠樹突狀細(xì)胞功能調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的影響①

周英武 彭桂英 顧立剛 殷勝駿

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治病毒性疾病教育部重點實驗室,北京 100029）

目的:利用基因芯片技術(shù)檢測人參皂苷Rg1對小鼠骨髓來源DC細(xì)胞功能調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法:分離C57小鼠骨髓細(xì)胞,經(jīng)GM-CSF、IL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)6天的未成熟DC細(xì)胞（iDC）經(jīng)不同因素處理并分為:對照組（Ⅰ）、人參皂苷Rg1組（Ⅱ）、內(nèi)毒素（LPS）組（Ⅲ）、Rg1+LPS組（Ⅳ）,24小時后收集各組細(xì)胞,抽提總RNA,利用樹突狀和抗原呈遞細(xì)胞基因芯片對細(xì)胞功能相關(guān)基因進(jìn)行檢測。結(jié)果:（Ⅱ/Ⅰ）上調(diào)≥2倍基因23個,下調(diào)≥2倍基因45個;（Ⅲ/Ⅰ）上調(diào)≥2倍基因15個,下調(diào)≥2倍基因47個;（Ⅳ/Ⅱ）上調(diào)≥2倍基因35個,下調(diào)≥2倍基因15個;（Ⅳ/Ⅲ）上調(diào)≥2倍基因37個,下調(diào)≥2基因10個。這些基因功能主要涉及細(xì)胞因子分泌及其受體表達(dá)、抗原攝取、抗原提呈、細(xì)胞表面受體、信號傳導(dǎo)。結(jié)論:人參皂苷Rg1對DC作用涉及多個基因的表達(dá)調(diào)控,這些基因控制并影響著DC功能、分化和成熟,為進(jìn)一步尋找藥物靶點提供了線索。

人參皂苷Rg1;樹突狀細(xì)胞;基因芯片

人參具有的補氣生血和扶正祛邪等功效與其調(diào) 節(jié)機體免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān),人參皂苷單體Rg1（ginsenoside Rg1）是人參三醇組皂苷的一個代表性單體,被認(rèn)為是其主要活性成分,對心血管、神經(jīng)系統(tǒng)及免疫功能等具有廣泛的藥理作用[1-3]。樹突狀細(xì)胞（Dendriticcell,DC）是機體內(nèi)最重要、功能最強的專職抗原提呈細(xì)胞,它啟動并連接了天然免疫和獲得性免疫,特異性地激活T、B淋巴細(xì)胞,通過募集炎性分子在炎癥部位的聚集以及自身在病灶的浸潤,參與炎性反應(yīng)[4,5]。前期研究表明,人參皂苷Rg1具有促進(jìn)成熟樹突狀細(xì)胞表面粘附分子和共刺激分子的表達(dá),刺激T細(xì)胞增殖等作用[6]。為進(jìn)一步探討其調(diào)控機制,我們采用了基因芯片技術(shù),檢測人參皂苷Rg1對DC細(xì)胞功能調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人參皂苷Rg1購于中國藥品生物制品檢定所（批號 110703-200424）,淡黃色粉末,用RPM I1640溶液配制成2 mg/m l的溶液,并用0.22 μm的濾器（Millpore）過濾除菌;TRIZOL試劑（Invitrogen life technologies）;Oligo Dendritic&Antigen Presenting CellGene Array（OMM-406,SuperArray）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理 按照文獻(xiàn)[7]略做改進(jìn),制備樹突狀細(xì)胞。無菌條件下取C57小鼠骨髓細(xì)胞,計數(shù),用完全 RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度為1×106個/m l細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中,并加入GMCSF（終濃度為40 ng/m l）及IL-4（終濃度為20 ng/m l）,37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)6天。第3、5天半量換液,并補充相應(yīng)細(xì)胞因子。在培養(yǎng)的第6天將iDC進(jìn)行分組,經(jīng)不同處理:對照組（Ⅰ）不做任何處理;人參皂苷Rg1組（Ⅱ）加入 Rg1使其終濃度為40 μg/ml;LPS組（Ⅲ）加入LPS使其終濃度為1μg/ml;人參皂苷Rg1+LPS組（Ⅳ）分別加入人參皂苷Rg1和LPS使其終濃度分別為40μg/m l和1μg/ml;37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24小時后,收集各組細(xì)胞。

1.2.2 RNA抽提及質(zhì)量檢測 加入TRIZOL試劑反復(fù)吹打裂解細(xì)胞,抽提RNA,用DNaseⅠ消化RNA樣品,去除其中可能含有的基因組DNA,然后用RNeasy MinEluteTM純化試劑盒（Qiagen）純化所得RNA,紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和純度。

1.2.3 cDNA標(biāo)記與合成 將樣品RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中加入RNA擴增緩沖液,生物素標(biāo)記的UTP和擴增酶類混合液,合成生物素標(biāo)記的cRNA探針,然后使用SuperArray ArrayGrade cRNA純化試劑盒純化cRNA探針。

1.2.4 芯片雜交 將純化的cRNA探針在GEAhyb雜交液中與Oligo GEA rray芯片雜交。

1.2.5 化學(xué)發(fā)光檢測 探針與芯片雜交后,加入鏈親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酶（AP）及化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)。X射線膠片曝光后,在膠片上顯示檢測結(jié)果。

1.2.6 圖像采集和數(shù)據(jù)分析 X射線曝光膠片后,將膠片上的圖像掃描并轉(zhuǎn)換為灰度TIFF格式的圖片文件。運行ScanAlyze軟件,將灰度TIFF格式圖片的點陣轉(zhuǎn)化為數(shù)字型數(shù)據(jù),將此原始數(shù)據(jù)儲存為M icrosoft Excel文件。運用GEA rray表達(dá)分析配套軟件（GEArray Expression Analysis Suite）進(jìn)行完整的芯片數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取并鑒定 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的RNA溶液A260/A280的比值在1.8～2.0之間。變性瓊脂糖凝膠電泳RNA條帶清晰,28S∶18S rRNA條帶亮度接近 2∶1,結(jié)果見圖 1。

2.2 基因芯片檢測結(jié)果分析

2.2.1 基因芯片分析 芯片上包含260個與抗原提呈細(xì)胞功能相關(guān)的基因,另外包括管家基因7個、陰性對照基因及背景點等28個,共計12行、24列。為監(jiān)控芯片雜交體系的整個過程,在芯片上設(shè)置陰性對照,雜交時信號很低,說明背景低。此外管家基因轉(zhuǎn)錄水平平均無顯著變化,說明芯片的結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性和可靠性,結(jié)果見圖2。

2.2.2 差異基因的統(tǒng)計 使用6μg的cRNA樣品,是芯片上的大部分表達(dá)豐度較高的基因信號。經(jīng)終濃度為40μg/m l的人參皂苷Rg1和 1μg/m l LPS處理24小時后,人參皂苷Rg1組與對照組相比較（Ⅱ/Ⅰ）上調(diào)≥2倍基因23個,下調(diào)≥2倍基因45個;LPS組與對照組相比較（Ⅲ/Ⅰ）上調(diào)≥2倍基因15個,下調(diào)≥2倍基因 47個;人參皂苷 Rg1+LPS組與人參皂苷 Rg1組相比（Ⅳ/Ⅱ）上調(diào)≥2倍基因35個,下調(diào)≥2倍基因 15個;人參皂苷 Rg1+LPS組與LPS組相比（Ⅳ/Ⅲ）上調(diào)≥2倍基因37個,下調(diào)≥2倍基因10個。表1和表2顯示的是差異表達(dá)值高于5倍或小于0.2倍。

圖1 RNA變性瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 RNA denaturing agarose gelelectrophoresis

圖2 基因芯片掃描結(jié)果Fig.2 The Results ofm icroarray after scan

表1 差異表達(dá)明顯上調(diào)的基因（大于5）Tab.1 Significant up-regulation of gene expression（above 5）

表2 差異表達(dá)明顯下調(diào)的基因（小于0.2）Tab.2 Significant down-regulation of gene expression（below 0.2）

3 討論

人參皂苷Rg1是人參的主要活性物質(zhì),具有增強免疫力及抗衰老活性。有研究表明,Rg1可通過增強前體DC與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,從而促進(jìn)DC前體細(xì)胞的移行和發(fā)育成熟;增加DC分泌IL-12 P40蛋白及其mRNA的轉(zhuǎn)錄,刺激T細(xì)胞的增殖及增強LPAK細(xì)胞殺傷腫瘤的活力,具有啟動和增強免疫應(yīng)答的作用,但其機制有待進(jìn)一步研究[8,9]?；蛐酒且环N特異、高效、快速的現(xiàn)代檢測技術(shù),被廣泛用于免疫學(xué)研究,如免疫細(xì)胞的分化、成熟、活化以及表型的改變,它能同時檢測上千個基因的變化,全面反映細(xì)胞基因變化水平。現(xiàn)代免疫學(xué)認(rèn)為,基因變化與免疫藥理存在一定聯(lián)系,在研究藥物對機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié),尋找藥物靶向,基因芯片更體現(xiàn)其優(yōu)越性,可以為中藥藥理研究提供了一種有效途徑[10]。

DC是最強的抗原提呈細(xì)胞,能活化初始T細(xì)胞,是特異性免疫應(yīng)答的啟動因素[11]。本實驗取C57小鼠骨髓來源細(xì)胞,用人參皂苷Rg1處理,基因芯片檢測不同狀態(tài)DC功能相關(guān)基因的表達(dá),研究發(fā)現(xiàn),不同劑量濃度 Rg1作用于DC,發(fā)現(xiàn)40μg/ml濃度能顯著促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分泌IL-12等細(xì)胞因子,因此基因芯片分析采用此濃度。同時發(fā)現(xiàn),經(jīng)人參皂苷Rg1處理后的DC,不論是在成熟還是非成熟階段,其功能相關(guān)基因表達(dá)都發(fā)生了明顯變化,這些基因?qū)C的遷移、抗原攝取、抗原吞噬、抗原提呈以及自身分化成熟起著至關(guān)重要的作用。初步研究顯示,人參皂苷Rg1和LPS對iDC作用主要表現(xiàn)為協(xié)同促進(jìn)作用,在一定意義上可認(rèn)為,人參皂苷Rg1促進(jìn)了mDC的功能。這些基因在DC發(fā)育的不同階段,其表達(dá)水平可以一致,也可不同,有時甚至相反。如:在iDC階段,人參皂苷 Rg1促進(jìn)了 Anpep、Areg、ccl25 、cd2 、cd1d1、cd5、Csf3、Cxcl1、Ifi44 、Ifit1、IL-12b 、IL-17f、IL-1a、IL-4、Lta、Mx2、Tnfrsf11 基因表達(dá),在與LPS共同作用于DC細(xì)胞后,這些基因的表達(dá)仍然處于一種高水平狀態(tài),這種一致性說明,人參皂苷Rg1促進(jìn)了DC的基因表達(dá)。其中,cd2、cd1d1、Mx2具有抗原呈遞攝取功能;Anpep、Ifi44、Ifit1、Lta為信號傳導(dǎo)分子;cd5是細(xì)胞表面受體 ;A reg、ccl25、Csf3、Cxcl1、IL-1a、IL-4、IL-12b、IL-17f、Tnfrsf11b 是細(xì)胞因子、趨化因子及其受體。以上結(jié)果表明人參皂苷Rg1對DC的調(diào)控可能涉及到多個靶點。

從實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在Ⅳ/Ⅲ（即LPS+Rg1組/LPS組）差異表達(dá)基因中,Erbb2和Ifi44均高表達(dá)。Erbb2作為細(xì)胞表面膜受體,是表皮生長因子受體（EGFR）家族成員之一[12];而Ifi44又稱p44,位于胞漿內(nèi),是IFN-α/β的誘導(dǎo)基因,是干擾素抗病毒途徑中的一個重要分子[13]?？紤]到Erbb2是EGFR家族成員,我們認(rèn)為Rg1可能通過和DC表面EGFR相結(jié)合,從而啟動EGFR-p44MAPK信號通路從而產(chǎn)生下游的作用。而且單純用Rg1刺激DC,也發(fā)現(xiàn)Ifi44轉(zhuǎn)錄水平明顯增高（比值為2.8）,進(jìn)一步證實我們推測的可能性。

此外,我們用ELISA檢測人參皂苷Rg1影響DC分泌IL-12和IL-4的情況（數(shù)據(jù)待發(fā)表）,發(fā)現(xiàn)二者均上調(diào),這也和基因芯片結(jié)果（IL-12和IL-4差異表達(dá)值分別為3.84和2.57）一致,一方面證明基因芯片結(jié)果的可靠性,另一方面表明人參皂苷Rg1影響DC的功能,誘導(dǎo)了混合型Th1/Th2免疫反應(yīng),這與人參具有的雙向調(diào)節(jié)作用一致。

綜上所述,人參皂苷Rg1對DC功能調(diào)控涉及多基因、多靶點,這些基因貫穿了DC分化、成熟與凋亡整個過程,控制著DC的細(xì)胞因子分泌、受體表達(dá)、吞噬和抗原提呈功能。但有關(guān)EGFR-p44MAPK信號通路以及差異表達(dá)明顯上調(diào)的相關(guān)蛋白功能還有待進(jìn)一步研究確定。

1 ChengY,Shen LH,Zhang JT.Anti-amnestic and anti-aging effectsofginsenoside Rg1 and Rb1 and itsmechanism of action[J].Acta Pharmacol Sin,2005;26（2）:143-149.

2 Zhang JT.Nootropicmechanisms of ginsenoside Rg1--influence on neuronal plasticity and neurogenesis[J].Acta Pharm Sin,2005;40（5）:385-388.

3 Zhao CH,Chen XC,Zhu Y Getal.Rolesof telomere and telomerase in the processofginsenoside Rg1 protection against tert-butyl hydroperoxideinduced senescence in WI-38 cells[J].Chin Pharmacol Bull,2005;21（1）:61-66.

4 Gervais A,ToutiraisO,Bouet-Toussaint Fetal.In vitro antitumor lymphocyte generation using dendritic cells and innate immunity mechanisms as tumor cell treatments[J].Anticancer Research,2007;27（4B）:2385-2392.

5 Watanabe S,YamakawaM,HiroakiTetal.Correlation of dendritic cell infiltration with active crypt inflammation in ulcerative colitis[J].Clin Immunol,2007;122（3）:288-297.

6 王 毅,郝 鈺,邱全瑛etal.人參皂甙Rg1、Rh1對樹突狀細(xì)胞刺激T細(xì)胞增殖及LPAK抗腫瘤活性的影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2003;19（4）:248-252.

7 Boudreau J,Koshy S,Cummings D,Wan Y.Culture ofmyeloid dendritic cells from bonemarrow precursors[J].JVis Exp,2008;25（17）:769-769.

8 王 毅,王本祥,劉鐵漢etal.人參皂苷Rg1的腸內(nèi)菌代謝Ⅱ.人參皂苷Rg1和Rh1免疫活性[J].中國藥理學(xué)報（英文版）,2000;21（9）:792-796.

9 王 毅,郝 鈺,婁金麗etal.人參皂苷Rg1和 Rh1對樹突狀細(xì)胞功能的影響[J].中國病理生理雜志,2004;20（10）:1764-1764.

10 馬宇瀅,張新民.基因芯片技術(shù)在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用及其對中醫(yī)藥研究的啟發(fā)[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報,2004;2（2）:90-93.

11 Stuart LM,LucasM,Simpson Cetal.Inhibitory effectsof apoptotic cell ingestion upon endotoxin-drivenmyeloid dendritic cellmaturation[J].J Immunol,2002;168（4）:1627-1635.

12 Alison Reid,Laura Vidal,Heather Shawetal.Dual inhibition of ErbB1（EGFR/HER1）and ErbB2（HER2/neu）[J].Euro JCancer,2007;43（3）:481-489.

13 Lin L,Hwang Y,Chen E Y.Gene-gene and gene-environmentinteractions in interferon therapy for chronic hepatitis C[J].FutureMedicine,2007;8（10）:1327-1335.

[收稿2010-04-29 修回2010-07-09]

（編輯 倪 鵬）

Identification of the regulatory effect of Ginsenoside-Rg1 on functional regulation gene expressing in murine dendritic cell by bio-chip technology

ZHOUYing-Wu,PENGGui-Ying,GULi-Gang,YINSheng-Jun.KeyLaboratoryofChineseMedicineonViralInfectious Disease,BeijingUniversityofChineseMedicine,MinistryofEducation,Beijing100029,China

Objective:cDNA microarrary technique was emp loyed to detect the effects of ginsenoside-Rg1 on functional regu lation of gene expressing inmurinemarrow-derived dendritic cells.Methods:Immature dendritic cells（iDC）derived from bonemarrow of C57m ice were induced by GM-CSF and IL-4 for six days in vitro and

different treatments for 24 h.Then the cellswere divided into themedia control group（Ⅰ）,ginsenoside Rg1 group（Ⅱ）,LPSgroup（Ⅲ）and ginsenoside Rg1 plus LPSgroup（Ⅳ）.24 h later,total RNA of the cells was collected,and four chips ofOligo Dendritic&Antigen Presenting CellGene Array were used to investigate the transcription levels of the functional genes from dendritic cells.Results:Therewere twenty-three genes up-regulated and forty five genes down-regulated two-folds above inⅡ/Ⅰ;fifteen genes up-regulated and forty seven genes down-regulated two-folds above inⅢ/Ⅰ;thirty fivegenesup-regulated and fifteen genes down-regulated two-folds above inⅣ/Ⅱ;thirty seven genes up-regulated and ten genes down-regulated two-folds above inⅣ/Ⅲ.The function of these genes involves the secretion of the cytokines and the exp ression of their receptors,antigen uptake and p resentation,cell surface receptors and signal transduction.Conclusion:The effects of ginsenoside-Rg1 on dendritic cell involve in multi-regulation and expression of geneswhich contribute to the functions,differentiation and maturation of the dendritic cells.This study provides a clue to further seek the target ofmedicine.

Ginsenoside-Rg1;Dendritic cell;Microarrary

R285.5

A

1000-484X（2010）12-1086-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.007

①本文為國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目（No.30701105）

周英武（1974年-）,男,在讀博士,講師,主要從事中醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)的分子機制研究,E-mail:zhouyingwuhn@163.com;

及指導(dǎo)教師:彭桂英（1978年-）,女,博士,副教授,主要從事中醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)的分子機制研究,E-mail:penggy@bucm.edu.cn。