王麗君 石莉萍 （北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院,吉林 132013）

王麗君 石莉萍 （北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院,吉林 132013）

目的:探討龍牙木多糖（AEPS）對(duì)體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響,并探討其可能的作用機(jī)制。方法:熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率;Western blot檢測(cè)不同濃度AEPS作用36小時(shí)凋亡蛋白 survivin、caspase-3及bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果:與對(duì)照組比較,AEPS不同濃度劑量組Hoechst33258/PI熒光染色出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變;FCM檢測(cè)表明SMMC-7721細(xì)胞凋亡率各實(shí)驗(yàn)組均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）,且呈時(shí)間劑量依賴(lài)性;Western blot顯示與對(duì)照組相比,各實(shí)驗(yàn)組AEPS可顯著下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞 survivin和bcl-2的表達(dá)（P＜0.01）,而caspase-3的表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論:AEPS能明顯誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與改變凋亡相關(guān)基因survivin、caspase-3及bcl-2的表達(dá)有關(guān)。

龍牙木多糖;凋亡;survivin;caspase-3;bcl-2

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 AEPS（純度96.83%）由本實(shí)驗(yàn)室制備,SMMC-7721肝癌細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所）,DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco BRL公司）,胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）,碘化丙啶（PI）（美國(guó) Caltag公司）,β-actin、bcl-2,survivin、caspase-3抗體（Santa Cruz Biotechnologies公司）,流式細(xì)胞儀（FCM）（美國(guó)Beckman coulter公司）,Annexin/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（北京寶賽公司）,Hoechst33258/PI熒光染色試劑盒（美國(guó)Sigma公司）,BX51TF熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100 U/m l青霉素和100 U/m l鏈霉素）中,于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用0.25%的胰酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 熒光顯微鏡觀察SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡將1×106細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24小時(shí)后,分別加入 50、100、200 μg/ml的 AEPS,同時(shí)設(shè)對(duì)照組,48小時(shí)后行常規(guī)細(xì)胞涂片,固定,Hoechst33258/PI染色后封固,熒光顯微鏡下觀察,記錄細(xì)胞形態(tài)變化情況,拍照。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板中,加入AEPS使其終濃度分別為50μg/m l（低劑量組）、100μg/m l（中劑量組）、200 μg/ml（高劑量組）,處理細(xì)胞12、24、36、48 小時(shí)后,用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化,計(jì)數(shù)后取約5×105個(gè)細(xì)胞,1 000 r/min離心5分鐘后棄上清液,用預(yù)冷PBS洗滌2次,按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入Annexin V-FITC 10μl和PI 5μl,避光室溫反應(yīng)15分鐘,在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比率。使用CellQuest軟件獲取細(xì)胞信息,Winmdi軟件分析細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,另設(shè)空白對(duì)照組。

1.2.4 Western blot檢測(cè) survivin、caspase-3和bcl-2蛋白表達(dá) 應(yīng)用Western blot技術(shù),以β-actin作為內(nèi)照物,比較各組 survivin、caspase-3和bcl-2蛋白表達(dá)水平的改變。作用36小時(shí)后分別收集空白對(duì)照組、AEPS 50、100、200μg/ml劑量組的細(xì)胞,PBS洗3次,加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液,裂解后離心取上清,用Bradford法測(cè)定各種蛋白的濃度。分別取蛋白樣品,按體積比4∶1加入上樣緩沖液,100℃、5分鐘變性,經(jīng)SDS-PAGE（5%的濃縮膠,18%的分離膠）電泳分離后,將蛋白電轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜經(jīng)脫脂奶粉封閉液封閉,將硝酸纖維素膜分別加入稀釋后一抗,再用相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶（HPR）標(biāo)記的二抗稀釋液孵育,用 ECL發(fā)光法檢測(cè)不同樣品各種蛋白表達(dá)狀況。圖像以Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)分析,用目的蛋白條帶的平均光強(qiáng)度值與β-actin條帶的平均光強(qiáng)度值的比值表示該蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst33258/PI雙染法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變 AEPS 50、100、200 μg/m l處理SMMC-7721 細(xì)胞48小時(shí),Hoechst 33258/PI熒光染色結(jié)果見(jiàn)圖1。不同濃度AEPS處理SMMC-7721細(xì)胞48小時(shí)后,出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。染色質(zhì)分布均勻的藍(lán)色細(xì)胞為正常細(xì)胞。細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、分布不均、產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光為凋亡細(xì)胞,染成紅藍(lán)色為晚期凋亡細(xì)胞,染成紅色熒光為壞死細(xì)胞。50、100、200μg/m l處理過(guò)的凋亡率均顯著高于對(duì)照組,但壞死率也高于對(duì)照組。

2.2 FCM檢測(cè)AEPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率的影響 各組細(xì)胞在AEPS作用12小時(shí)后即出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象（圖2）,低、中、高劑量組凋亡率分別為（10.14±0.91）%、（12.32±1.50）%和（14.53±1.97）%,與空白對(duì)照組細(xì)胞（5.31±0.65）%比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;其余時(shí)間點(diǎn)各組比較,AEPS處理組凋亡率均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;另外,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象越來(lái)越明顯,同時(shí)在同一時(shí)間點(diǎn)隨著AEPS濃度增加,細(xì)胞凋亡率亦增加,呈現(xiàn)明顯的劑量/時(shí)間正向依賴(lài)關(guān)系（圖3）。

圖1 熒光顯微鏡觀察SMMC-7721肝癌細(xì)胞凋亡（×400）Fig.1 The apop tosis of SMMC-7721 cells were observed by the fluorescentm icroscope（×400）

圖2 SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)不同濃度AEPS處理12小時(shí)后凋亡情況Fig.2 Apoptosis rate in SMMC-7721 cells after treatment with various concentrations of AEPS for 12 h

圖4 AEPS對(duì) SMMC-7721細(xì)胞 survivin、caspase-3及bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The expression levels of survivin,caspase-3 and bcl-2 in SMMC-7721 cells after treatment with various concentrations of AEPS

圖3 SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)不同濃度AEPS處理后凋亡情況Fig.3 Apoptosis rate in SMMC-7721 cells after treatment with various concentrations of AEPS

2.3 AEPS對(duì)SMMC-7721細(xì)胞survivin、caspase-3及bcl-2蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)顯示經(jīng)50、100、200μg/ml AEPS處理SMMC-7721細(xì)胞36小時(shí),結(jié)果見(jiàn)圖4A。蛋白條帶相對(duì)強(qiáng)度圖表明（圖4B）,不同濃度的AEPS作用SMMC-7721細(xì)胞后,survivin和bcl-2的蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì),200μg/m l AEPS作用SMMC-7721細(xì)胞幾乎完全抑制survivin的表達(dá),而caspase-3的表達(dá)卻顯著升高,其效應(yīng)均具有濃度梯度依賴(lài)性。

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程,細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中主要起負(fù)調(diào)控作用[4]。細(xì)胞凋亡受抑是腫瘤的發(fā)病機(jī)制之一,細(xì)胞凋亡的失衡導(dǎo)致腫瘤發(fā)生并影響腫瘤的生物學(xué)行為[5,6]。首先,本研究檢測(cè)了AEPS處理SMMC-7721細(xì)胞后的凋亡情況,結(jié)果顯示與對(duì)照組比較,AEPS不同濃度劑量組Hoechst33258/PI熒光染色出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變;FCM檢測(cè)表明AEPS處理細(xì)胞12小時(shí)后,SMMC-7721細(xì)胞即出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,且存在劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。由此推測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是AEPS抗腫瘤作用機(jī)制之一。

survivin是新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白家族成員,也是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子,survivin的過(guò)度表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡,有利于細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。caspase-3是caspase家族中重要的凋亡執(zhí)行者之一,抑制caspase-3的活性或拮抗其功能可使細(xì)胞凋亡受抑。功能強(qiáng)大的凋亡抑制基因survivin主要在凋亡通路的下游抑制caspase-3發(fā)揮抗凋亡的效應(yīng)[7]。為此,我們采用Western blot檢測(cè)了相關(guān)凋亡蛋白survivin和 caspase-3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示抑制凋亡蛋白survivin在AEPS誘導(dǎo)下出現(xiàn)了表達(dá)顯著下調(diào),而致凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)顯著增加,從而導(dǎo)致SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

bcl-2蛋白的功能是阻遏細(xì)胞凋亡,并能協(xié)助細(xì)胞抵抗免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用,最終導(dǎo)致腫瘤的形成,其過(guò)度表達(dá)已被證實(shí)存在于多種腫瘤組織中。本研究結(jié)果表明AEPS可顯著下調(diào)SMMC-7721細(xì)胞bcl-2的表達(dá)（P＜0.01）,提示AEPS誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡還可能與bcl-2的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

caspase家族是細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶,許多凋亡誘導(dǎo)劑可通過(guò) caspases依賴(lài)的方式誘導(dǎo)。Survivin家族凋亡相關(guān)基因通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體途徑影響凋亡的發(fā)生,survivin可直接與 caspase-3、caspase-7結(jié)合并抑制它們的活性[8,9]。bcl-2家族成員與線(xiàn)粒體膜通透性相關(guān)并調(diào)結(jié)膜的完整性[10]。本研究中AEPS誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞凋亡,一方面可能與下調(diào)survivin和bcl-2表達(dá)有關(guān),另一方面還可能通過(guò)增加caspase-3的表達(dá)。這些研究結(jié)果提示,線(xiàn)粒體途徑可能是AEPS誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一。

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10 Adams JM,Cory S.The Bcl-2 protein fam ily:arbiters of cell survival[J].Science,1998;281:1322-1326.

[收稿2010-08-27]

（編輯 張曉舟）

AEPS induces apoptosis in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells and itsmechanism

WANGLi-Jun,SHILi-Ping.CollegeofChemistryandBiology,BeihuaUniversity,Jilin132013,China

Objective:To study themechanism of apoptosis induced by AEPS in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells.Methods:The fluorescentmicroscopewas utilized to observe themorphological changes of apoptosis,apoptosis rate were detected with flow cytometry.Western b lot was utilized to detect the expression of survivin,caspase-3 and bcl-2.Results:Typicalmorphological changes of apoptosis in SMMC-7721 cancer cells could be observed by the fluorescencemicroscope.Compared with thatof the control cells,apoptotic rate of the cells treatedwith AEPSwas increased signifcantly（P＜0.01）and ina dose-and time-dependentmanner.Western blot showed thatsurvivin and bcl-2 expressionwas signifcantly decreased（P＜0.01）,whereas caspase-3 expressionwas signifcantly increased（P＜0.01）in SMMC-7721 cancer cells treated with AEPS.Conclusion:AEPS can markedly induce apoptosis in SMMC-7721 hepatocellular cancer cells.The mechanism might be related to the change of survivin,caspase-3 and bcl-2 exp ression.

Polysaccharide ofAraliaelataSeem（AEPS）;Apoptosis;survivin;caspase-3;bcl-2

R735.7 R392.1 R730.1

A

1000-484X（2010）12-1082-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.006

①本文為吉林省科技廳資助項(xiàng)目（20080913）

王麗君（1964年-）,女,碩士,教授,主要從事天然藥物化學(xué)成分及生物活性的研究,E-mail:lijun0926@163.com。