付 嘉 方艷秋 司傳平 熊 斌 譚 巖 徐 立 （濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院免疫教研室,濟(jì)寧 272013）

口服重組β2糖蛋白1的實(shí)驗(yàn)性抗磷脂綜合征小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Foxp3mRNA表達(dá)變化①

付 嘉 方艷秋②③司傳平 熊 斌③④譚 巖②徐 立⑤（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院免疫教研室,濟(jì)寧 272013）

目的:觀察口服重組人β2糖蛋白1（rhβ2GP1）的實(shí)驗(yàn)性抗磷脂綜合征（EAPS）小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（CD4+CD25+Treg）數(shù)量和功能變化,探討EAPS口服耐受機(jī)制。方法:以 rhβ2GP1主動(dòng)免疫 BALB/c小鼠建立EAPS模型,口服耐受組在EAPS小鼠免疫10天前經(jīng)胃腸道給予rhβ2GP1,在免疫12周后檢測(cè)各組小鼠抗β2糖蛋白1抗體（anti-β2-GP1）、抗心磷脂抗體（aCL）、流產(chǎn)率（%）、活化部分凝血活酶時(shí)間（aPTT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT PBC）;以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組小鼠PBMC中CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分率;RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA的表達(dá)。結(jié)果:耐受組小鼠與模型組相比,anti-β2-GP1、aCL水平明顯降低,aPTT縮短,PLTPBC升高,流產(chǎn)率降低,均具有顯著性差異（P＜0.05）;耐受組小鼠PBMC中Foxp3m RNA表達(dá)在第4、8、12周均高于對(duì)照組（P＜0.05）,此后下降,20周時(shí)與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）,4周時(shí)與模型組無(wú)差異（P＞0.05）,8周后模型組逐漸降低,12周后降低明顯（P＜0.05）;耐受組PBMC中CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分率與對(duì)照組相比,未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論:CD4+CD25+Treg在口服耐受的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用。

抗磷脂綜合征;口服耐受;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞;Foxp3

①本文受山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2010CL017）、濟(jì)寧市科技局項(xiàng)目、濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)科研項(xiàng)目、吉林省杰出青年基金（No.20050113）、吉林省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目（No.20060722）和吉林省科技廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（No.200705101）資助

②吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心,長(zhǎng)春130021

③通訊作者,E-mail:yq.fang@163.com;E-mail:xiongbin1116@yahoo.cn

④濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院外科總論教研室,濟(jì)寧272013

⑤吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,長(zhǎng)春130021

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（CD4+CD25+regulatory T cell,Treg）是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中最為重要的一群,因其具有免疫調(diào)節(jié)和抑制作用,近年來(lái)受到研究者的密切關(guān)注。研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)于維持機(jī)體免疫自穩(wěn)、防止自身免疫病具有極其重要的作用,資料顯示CD4+CD25+Treg的數(shù)量減少或功能異常與多種自身免疫病相關(guān)[1-3]。

抗磷脂綜合征（Antiphospholipid syndrome,APS）是一種以動(dòng)靜脈血栓形成,習(xí)慣性流產(chǎn)為特征的自身免疫病[4]。APS的確切病因目前還不很清楚,來(lái)自國(guó)內(nèi)外研究顯示抗β2糖蛋白 1抗體（antiβ2GP1）、抗心磷脂抗體（ACA）、致炎因子生成,內(nèi)皮細(xì)胞和血小板活化,凝血因子、補(bǔ)體及Toll樣受體的激活等機(jī)制參與APS的發(fā)病[5]。目前對(duì)APS的治療以大劑量的抗凝劑及免疫抑制劑為主要方法,長(zhǎng)期使用會(huì)帶來(lái)明顯的副作用及危險(xiǎn)性。故而有必要探索更為安全的治療方法[6]。

口服抗原或自身抗原誘導(dǎo)抗原特異性系統(tǒng)免疫低反應(yīng)性的狀態(tài)稱(chēng)為口服耐受。許多研究者將這種天然耐受途徑作為抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫病及延長(zhǎng)移植物存活的方法,也用于治療人類(lèi)自身免疫病[1]。本課題組前期研究顯示:維持機(jī)體免疫自穩(wěn)發(fā)揮重要作用的CD4+CD25+Treg參與EAPS的發(fā)病,且口服rhβ2GP1對(duì) EAPS可有一定的緩解[7,8]。但對(duì)CD4+CD25+Treg是否參與EAPS口服耐受機(jī)制,國(guó)內(nèi)外卻未見(jiàn)報(bào)道。

為進(jìn)一步了解CD4+CD25+Treg在誘導(dǎo)EAPS口服耐受中所發(fā)揮的作用,本研究組擬將口服rhβ2GP1的EAPS小鼠與EAPS模型小鼠進(jìn)行對(duì)比,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠PBMC中CD4+CD25+Treg細(xì)胞百分率及以RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA的表達(dá)變化,以期為揭示EAPS口服耐受機(jī)制提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 流式細(xì)胞儀（BD公司）,抗小鼠 PE-anti-CD4、FITC-anti-CD25及同型對(duì)照 γ1/γ2（BD公司）;低溫高速離心機(jī)（Beckman）;CO2培養(yǎng)箱（GBB16 Heraus）;TRIZOL、Taq DNA 聚合酶;dNTP、MML-V逆轉(zhuǎn)錄酶等（晶美生物公司）;PCR引物（上海生工生物公司）;小鼠抗人β2-GP1單克隆抗體（鼎國(guó)生物公司）;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG（北京中山生物技術(shù)公司）;CFA（Sigma）;心磷脂標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）、β2-GP1標(biāo)準(zhǔn)品（Advtech）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠,雌性,8～10周,購(gòu)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,無(wú)特定病原菌（Specific pathogen free,SPF）條件下飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 人β2糖蛋白1的重組表達(dá) 見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將小鼠分為3組:口服耐受組、EAPS模型組及正常對(duì)照組。在EAPS模型建立前10天,三組小鼠用18號(hào)不銹鋼灌胃器分別以0.5 mg rhβ2GP1（前期研究顯示為合適時(shí)間及劑量）[7]/PBS/PBS灌胃,隔天灌胃1次,共5次。最后1次灌胃2天后開(kāi)始給動(dòng)物免疫。

1.3.3 rhβ2-GP1免疫方案 將20μg rhβ2-GP1與等體積的CFA混合至乳化后,足掌皮下注射模型及口服耐受組BALB/c小鼠,3周后采用等量rhβ2-GP1（溶于PBS）加強(qiáng)注射一次,正常對(duì)照組采用同樣方法以PBS/CFA免疫。免疫10周后將各組雌性小鼠與雄性小鼠合籠,次日上午檢查陰道栓是否形成,出現(xiàn)陰道栓的視為懷孕第一天,在懷孕第 15天（12周）檢測(cè) anti-β2GP1、aCL活化、部分凝血活酶時(shí)間（aPTT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT PBC）,并計(jì)算流產(chǎn)率（%）。

1.3.4 anti-β2-GP1、aCL的檢測(cè) 采用固相 ELISA檢測(cè)[10]。

1.3.5 流產(chǎn)率（%）的計(jì)算 流產(chǎn)率（%）=流產(chǎn)胚胎個(gè)數(shù)/（流產(chǎn)胚胎個(gè)數(shù)+未流產(chǎn)胚胎個(gè)數(shù)）。

1.3.6 aPTT的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.7 PLTPBC 應(yīng)用血細(xì)胞自動(dòng)分析儀計(jì)數(shù)血小板。

1.3.8 外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞的檢測(cè) 無(wú)菌取各組小鼠尾靜脈血,肝素抗凝。取100μl全血,分別加入抗CD4、抗 CD25抗體各10μl,另設(shè)對(duì)照管,加入同型陰性對(duì)照γ1/γ2,室溫孵育20～30分鐘,加入紅細(xì)胞裂解液,振蕩混勻,室溫孵育10分鐘。以2ml PBS 1 000 r/m in離心洗滌5分鐘,棄上清,將細(xì)胞懸浮于0.5ml PBS洗滌液中,振蕩混勻后上機(jī)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群及CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群水平。

1.3.9 PBMC中Foxp3mRNA表達(dá)的檢測(cè)

1.3.9.1 引物設(shè)計(jì) Foxp3引物P1:5′-CTGGATGAGAAAGGCAAGG-3′和 P2:5′-AAAGTGGATACGGTGGG AA-3′;GAPDH 引物 P3:5′-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3′和 P4:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.3.9.2 Foxp3mRNA表達(dá)的檢測(cè) 用Trizol試劑提取小鼠PBMC總mRNA,在42℃將1mg RNA逆轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系中加入2.5mmol/L dNTPs,2.5 U Taq DNA多聚酶,0.25μmol/L引物。反應(yīng)在PCR儀中進(jìn)行,94℃變性45秒,55℃退火60秒,72℃延伸60秒。擴(kuò)增前94℃變性90秒,之后72℃延伸 7分鐘,共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀對(duì)條帶進(jìn)行分析。電泳條帶以Foxp3的灰度值與GAPDH的灰度值的比值表示Foxp3mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的免疫反應(yīng)及表現(xiàn) 如表1所示,模型組小鼠與正常對(duì)照組相比,anti-β2-GP1、aCL滴度升高,流產(chǎn)率升高,PLTPBC降低,aPTT延長(zhǎng),差異具有顯著性（P＜0.05）;而口服耐受組小鼠與模型組相比較,anti-β2-GP1、aCL水平明顯降低,aPTT縮短,PLTPBC升高,流產(chǎn)率降低,差異具有顯著性（P＜0.05）,其中流產(chǎn)率和aPTT與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 小鼠PBMC中CD4+CD25+T細(xì)胞百分率變化分別在免疫后4、8、12、16、20周流式檢測(cè)三組小鼠的CD4+CD25+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的百分率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),耐受組在各時(shí)間段與正常對(duì)照組相比,未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）。模型組4、8周與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）,12周后開(kāi)始逐漸下降（P＜0.05）。對(duì)照組及耐受組在不同時(shí)間段比較未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05,圖1）。

2.3 小鼠PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA表達(dá)變化

免疫后4、8、12 、16、20 周三組小鼠 Foxp3mRNA 表達(dá)變化如圖2,模型組小鼠第4周表達(dá)水平短暫升高,與耐受組無(wú)差異（P＞0.05）;第8周表達(dá)有所下降,12周以后mRNA表達(dá)水平下降明顯（P＜0.05）;耐受組小鼠PBMC中Foxp3mRNA表達(dá)在4周、8周、12周時(shí)明顯高于模型組（P＜0.05）,12周后下降,20周與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）;對(duì)照組在不同時(shí)間比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)口服耐受、模型及對(duì)照組小鼠PBMC中CD4+CD25+T細(xì)胞百分率變化Fig.1 Dynam ic study of percentage of CD4+CD25+T cells from PBMC in oral tolerized/model/control group m iceby FACS

圖2 RT-PCR檢測(cè)口服耐受、模型及對(duì)照組小鼠PBMC中Foxp3 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynam ic study of Foxp3mRNA expression from PBMC in oral tolerized/model/control group m iceby RT-PCR

表1 口服耐受組及模型組小鼠的臨床表現(xiàn)Tab.1 Clinicalmanifestations in oral tolerance group and model group

3 討論

口服耐受作為一種外周免疫耐受方式,在維持腸道免疫穩(wěn)定及抑制病理性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[11]。利用此原理口服特異抗原誘導(dǎo)特異性免疫耐受,具有獨(dú)特的安全、特異的優(yōu)點(diǎn),為特異性治療自身免疫性疾病、食物過(guò)敏、腫瘤、移植等疾病提供了新的思路和途徑。故而吸引研究者重視和關(guān)注。口服耐受的機(jī)制有主動(dòng)抑制、免疫無(wú)能和缺失、旁路抑制等。哪種方式在口服耐受中起支配作用在很大程度上取決于口服抗原的劑量。高劑量誘發(fā)T細(xì)胞的克隆清除,而低劑量主要是口服抗原在腸道誘導(dǎo)了抗原特異性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）,對(duì)該抗原的系統(tǒng)免疫反應(yīng)發(fā)生主動(dòng)抑制。可能參與口服耐受的Treg包括CD4+CD25+CD8+Treg、Th3以及Tr1[12]。

CD4+CD25+Treg是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中最為重要的一群,因其在維持機(jī)體免疫自穩(wěn),防止自身免疫病具有極其重要的作用,近年來(lái)受到研究者的密切關(guān)注。CD4+CD25+Treg是一種組成性表達(dá)白細(xì)胞介素2（IL-2）受體α鏈（CD25）的CD4+T細(xì)胞,約占人和小鼠外周血CD4+T細(xì)胞的5%～10%,該細(xì)胞亞群主要在胸腺中分化、成熟,主要來(lái)源于 CD4+CD25-胸腺細(xì)胞,在CD4+T細(xì)胞的自然選擇過(guò)程中生成。其表面分子除高表達(dá)CD25外,還表達(dá)CD127-、CD45RBlow、CD5 、CD44、ICAM-1、LFA-1、部分CD62Lhigh及neuropilin-1等表面分子[13]。一系列研究發(fā)現(xiàn),叉狀頭/翅狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3（forkhead/winged helix transcription factor）對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育和功能維持是必需的。CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有免疫無(wú)能和免疫抑制兩大特性。對(duì)于CD4+CD25+Treg的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制,現(xiàn)在普遍認(rèn)為CD4+CD25+Treg通過(guò)與細(xì)胞接觸發(fā)揮抑制作用。體外研究表明,細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1和細(xì)胞相關(guān)分子CTLA-4、GITR在CD4+CD25+Treg功能的發(fā)揮中起了一定的作用[14]。CD4+CD25+Treg對(duì)機(jī)體維持自身免疫耐受非常重要,其數(shù)量減少或功能缺失均可導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[1-3]。近年來(lái),CD4+CD25+Treg已成為自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究組的前期工作顯示,CD4+CD25+Treg在EAPS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用,且口服rhβ2GP1對(duì)EAPS可有一定的緩解[7,8]。

本研究表明,在免疫第4周,自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞增殖活化的時(shí)期,模型組Foxp3mRNA表達(dá)短暫高于對(duì)照組（P＜0.05）,可能是機(jī)體適應(yīng)性的代償反應(yīng)[15]。隨著疾病進(jìn)展不斷下降,到12周以后低于對(duì)照組（P＜0.05）。模型組CD4+CD25+Treg細(xì)胞亞群百分率在4至8周基本維持正常（P＞0.05）,在此時(shí)期 CD4+CD25+Treg細(xì)胞與效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞可暫時(shí)保持平衡,機(jī)體對(duì)自身組織的耐受并未破壞。此后逐漸下降,均明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）,推測(cè)隨著疾病的進(jìn)展,自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生的大量致炎因子如TNF-α、IL-6等可抑制CD4+CD25+Treg的功能,故而隨著疾病進(jìn)展CD4+CD25+Treg細(xì)胞也相應(yīng)的下降,以致效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞不斷增殖,導(dǎo)致APS的發(fā)生,這與模型組的癥狀開(kāi)始出現(xiàn)的時(shí)間基本一致[16,17]?？诜褪芙M在免疫第4、8、12周Foxp3 mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組,提示此時(shí)期Foxp3mRNA表達(dá)活躍,與自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞增殖活化相適應(yīng),維持機(jī)體免疫平衡,抑制EAPS發(fā)生。在第12周后略降低,第20周接近對(duì)照組,隨著自身反應(yīng)性T、B淋巴細(xì)胞增殖活化的下降,Foxp3 mRNA表達(dá)出現(xiàn)適應(yīng)性變化,有所下降。耐受組小鼠外周血CD4+CD25+T細(xì)胞百分率在各時(shí)間段并未出現(xiàn)與Foxp3mRNA表達(dá)升高相適應(yīng)的變化,推測(cè)可因分化發(fā)育生成的CD4+CD25+T細(xì)胞向外周血及病變部位遷移而在體內(nèi)重新分布,維持機(jī)體免疫自身穩(wěn)定,故而并未見(jiàn)外周血中細(xì)胞百分率明顯變化[18]。同時(shí)與正常對(duì)照組相比,未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）,提示口服rhβ2GP1對(duì)在免疫造模的過(guò)程中機(jī)體免疫平衡的破壞具有明顯地糾正作用,在EAPS疾病進(jìn)展中免疫耐受并未被打破?？梢?jiàn)CD4+CD25+Treg不但參與EAPS的發(fā)病機(jī)制,而且在口服耐受的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。

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[收稿2010-09-10 修回2010-10-27]

（編輯 倪 鵬）

Changesof CD4+CD25+regulatory T cells and Foxp3 mRNA expression in m ice with experimentalanti-phospholipid syndrome fed w ith recombinant humanβ2-glycoprotein 1

FUJia,FANGYan-Qiu,SIChuan-Ping,XIONGBin,TANYan,XULi.DepartmentofImmunology,JiningMedical College,Jining272013,China

Objective:To observe thequantitative and functional changes of CD4+CD25+regulatory T cells（CD4+CD25+Treg）in experimental anti-phospholipid syndrome（EAPS）mice fed with recombinant human β2-glycoprotein 1（rhβ2-GP1）.Methods:EAPSmodelwas established by immunizing BALB/cmicewith rhβ2-GP1.In tolerized groups,EAPSmicewere fedwith rhβ2-GP1 10 daysbefore immunization.Anti-β2-glycop rotein 1（anti-β2GPI）,anticardiolipin（aCL）titers in the sera,rate of the fetal resorptions,activated partial thromboplastin time（aPTT）and platelet countswere assayed after12 weeks.Percentage of CD4+CD25+Treg in peripheral blood mononuclear cells in mice from each groupswere determ ined by flow cytometry,the expressions levels of Foxp3 mRNA were detected by RT-PCR.Results:In tolerizedm ice anti-β2GPIand aCL Abs decreased significantly（P＜0.05）,resorption percentage decreased（P＜0.05）,aPTT shortened（P＜0.05）,and p latelet counts elevated（P＜0.05）.The expressing levels of Foxp3mRNA in the tolerized groupwere higher than those of control group（P＜0.05）on the fourth,eighth,twelfth weeks after immunization（P＜0.05）,but they began to decrease after twelfth week and therewere no significant differences on twentieth weeks between tolerized groups and control group（P＞0.05）.Theexpressing levels of Foxp3mRNA in the tolerized group were paralleled tomodelgroup on fouthweek（P＞0.05）and the latterbegan to decrease aftereighth week andwere lower than thoseof control group significantly after twelfthweek（P＜0.05）.The percentageof CD4+CD25+Treg cells from PBMC in tolerized group were paralleled to those of controlgroup during oral tolerance induction（P＞0.05）.Conclusion:CD4+CD25+Treg cells play roles in the induction of oral tolerance in EAPS.

Anti-phospholipid syndrome;Oral tolerance;CD4+CD25+Treg;Foxp3

R392

A

1000-484X（2011）12-1073-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.004

付 嘉（1973年-）,女,博士,主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)方面的研究,E-mail:fujia730511@yahoo.com.cn。