何少林 李大主 黎 明 馬旭明 林 靜 昌 薇 趙 卉

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430022）

CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子分泌的影響①

何少林 李大主 黎 明 馬旭明 林 靜 昌 薇 趙 卉

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,武漢 430022）

目的:探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）對(duì)氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）VCAM-1、MCP-1、IL-6表達(dá)的影響。方法:磁性細(xì)胞分離器（MACS）分離 CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25-T細(xì)胞。在 ox-LDL作用下,將內(nèi)皮細(xì)胞分別與anti-CD3mAb激活的CD4+CD25+T細(xì)胞,CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。分別應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、real-time PCR測(cè)定Tregs對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)損傷HUVECs炎性因子VCAM-1、MCP-1、IL-6表達(dá)的影響。應(yīng)用Transwell小室及中和抗體實(shí)驗(yàn)觀察Tregs作用于HUVECs的具體機(jī)制。結(jié)果:與對(duì)照組比較,Tregs細(xì)胞可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)損傷HUVECs炎性因子VCAM-1、MCP-1、IL-6的表達(dá);被Transwell隔離或加入中和性抗體 anti-IL-10/anti-TGF-β后,Tregs對(duì)HUVECs的抑制作用可被部分逆轉(zhuǎn)。結(jié)論:Tregs細(xì)胞可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)損傷HUVECs炎性因子的表達(dá),其作用機(jī)制既依賴于細(xì)胞直接接觸,又依賴于細(xì)胞因子。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;氧化型低密度脂蛋白;炎性因子;Transwell

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種炎癥性疾病,血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷是其啟動(dòng)機(jī)制[1]。傳統(tǒng)的AS危險(xiǎn)因素如ox-LDL能刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性因子如血管細(xì)胞粘附分子-1（VCAM-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）,吸引炎性細(xì)胞并使其在局部粘附,進(jìn)而進(jìn)入內(nèi)膜下,產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[2]。近年研究發(fā)現(xiàn),Tregs作為體內(nèi)專職的炎癥負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞,具有抗AS的作用,但其抗AS的確切機(jī)制尚不清楚[3,4]。本文探討Tregs對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑:DMEM/F-12培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco-BRL公司,按說(shuō)明書配制,4℃保存;特級(jí)胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物制品公司,使用前56℃水浴30分鐘滅活補(bǔ)體后分裝,-20℃保存;ox-LDL購(gòu)于Sigma公司;DMSO購(gòu)于上海華美生物工程公司;人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所;FITC-anti human CD4、PE-anti human CD25、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞免疫磁珠（MACS）分選試劑盒購(gòu)于德國(guó)Miltenyi Biotec公司;human VCAM-1-PE、human MCP-1-PE、human IL-6-PE 、human IgGPE、human anti-CD3mAb OKT3購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司;Anti-IL-10 mAbs、anti-TGF-βmAbs、ELISA 試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司;Trizol試劑盒購(gòu)于Gibco-BRL公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于日本TOYOBO公司;實(shí)時(shí)定量試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司;引物設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GenBank中人基因序列,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成;Transwell購(gòu)于美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.2.1.1 HUVECs的培養(yǎng)及鑒定 新生兒臍帶由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科提供。取新生兒臍帶,PBS洗凈臍靜脈腔后灌注0.1% Ⅰ型膠原酶,血管鉗夾閉靜脈兩端 ,置37℃水浴箱12～15分鐘,收集消化液,1 200 r/min離心10分鐘,棄上清,加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基,置37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)24小時(shí),PBS洗去紅細(xì)胞及未貼壁細(xì)胞,加入含10%特級(jí)胎牛血清及內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加物（100mg/L）的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),2～3天換液一次。至貼壁細(xì)胞70%～80%融合時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3～6代用于試驗(yàn) 。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞呈單層鵝卵石樣排列,Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色陽(yáng)性,確定為內(nèi)皮細(xì)胞。

1.2.1.2 CD4+CD25+T細(xì)胞及CD4+CD25-T細(xì)胞的分離及激活 以無(wú)菌注射器采集外周血50 ml（來(lái)自健康志愿者）,肝素抗凝,密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）,收集的PBMCs用CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞免疫磁珠（MACS）分選試劑盒,陰性選擇獲得CD4+T細(xì)胞;加入PE標(biāo)記抗人CD25單克隆抗體,再加入磁珠標(biāo)記抗PE,陽(yáng)性選擇獲得CD4+CD25+T細(xì)胞,陰性選擇獲得CD4+CD25-T細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur）分析細(xì)胞純度,經(jīng)鑒定其純度分別＞92%和＞98%。將分選后的CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞分別用無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞至終濃度1×109cells/L,種入預(yù)先包被好human anti-CD3mAbsOKT3（10mg/L）的96孔板,每孔終體積100μl,孵育48小時(shí)。

1.2.2 Tregs與HUVECs的共培養(yǎng)及分組 CD4+CD25+T細(xì)胞,CD4+CD25-T細(xì)胞（均為 5×105細(xì)胞/孔）與抗人CD3mAbs（10mg/L）孵育48小時(shí)后,分別加入已種有內(nèi)皮細(xì)胞（3×106～4×106細(xì)胞/孔）的培養(yǎng)板,在終濃度均為50 mg/L的ox-LDL中共培養(yǎng)[5],分為3組:①ox-LDL誘導(dǎo)組（noT組）:HUVECs+50 mg/L ox-LDL;②CD4+CD25+T細(xì)胞組（25+組）:HUVECs+CD4+CD25+T細(xì)胞+50 mg/L ox-LDL;③CD4+CD25-細(xì)胞組（25-組）:HUVECs+CD4+CD25-T細(xì)胞+50mg/L ox-LDL。細(xì)胞置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時(shí)后,移去培養(yǎng)液,用 PBS輕洗2遍,去除未粘附細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶液消化收集HUVECs備用。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVECs VCAM-1、MCP-1、IL-6的表達(dá) 收集上述處理過(guò)的各組單個(gè)HUVECs,離心棄上清,80μl PBS液重懸,各組細(xì)胞分別加入單克隆抗體human VCAM-1-PE,humanMCP-1-PE,human IL-6-PE各20μl,4℃孵育30分鐘,加入含2%BSA、0.1%NaN3的 PBS液,1 200 r/min離心,10分鐘,反復(fù)洗2次。去上清,加入1%多聚甲醛PBS液（pH7.2）500μl,流式細(xì)胞儀檢測(cè),其結(jié)果以陽(yáng)性百分率表示。每份樣本均設(shè)陰性對(duì)照（加相應(yīng)IgG抗體）,以消除本底熒光的影響。

1.2.4 ELISA檢測(cè)上清液MCP-1、IL-6濃度 操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.5 Real-time Quantitative-PCR檢測(cè)HUVECs VCAM-1、MCP-1、IL-6 的基因表達(dá)

1.2.5.1 總RNA的提取 用一步法提取細(xì)胞總RNA。提取的總RNA經(jīng)電泳鑒定未被降解,用72-1分光光度計(jì)測(cè)RNA在260 nm和280 nm的吸光度（A）值,所有樣品的A 260/A280比值均介于1.9～2.1。根據(jù)260 nm的吸光度值對(duì)樣品的總RNA進(jìn)行初步定量。

1.2.5.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 應(yīng)用TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制20μl反應(yīng)體系,其中含 RNase free H2O 6μl、5×RT buffer 4 μl、dNTPMixture 2 μl、RNase Inhibitor 1 μl、Oligo（dT）1 μl、相當(dāng)于 1 μg的 RNA 樣品 5 μl、ReverTra Ace 1μl。在Tgradient梯度PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到 cDNA,溫度設(shè)置為30℃、10分鐘,42℃、20分鐘,85℃、5分鐘,4℃、5分鐘。

1.2.5.3 Real Time RT-PCR 應(yīng)用TaKaRa實(shí)時(shí)定量試劑盒配制25μl反應(yīng)體系,其中含SYBR Prem ix Ex Taq 12.5μl,PCR正義引物0.5μl、PCR 反義引物0.5 μl、cDNA 2 μl、dH2O 9.5 μl。VCAM-1 的上下游引物分別為 5′-CAT CCA CAA AGC TGC AAG AA-3′和 5′-CCTGGA TTCCCT TTTCCAGT-3′;MCP-1的上下游引物分別為 5′-CTC ATA GCA GCC ACC TTC ATTC-3′和 5′-CAA GTC TTCGGA GTT TGG GTT T-3′;IL-6的上下游引物分別為 5′-CAA ATT CGG TAC ATC CTC GAC GGC-3′和 5′-GGT TCA GGT TGT TTT CTGCCA GTG C-3′;GAPDH的上下游引物分別為5′-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3′和 5′-TCT AGA CCG CAG GTC AGG TCC ACC-3′。在 ABI Step one實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。相對(duì)基因表達(dá)水平用CT值比較法2-△△CT計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平差異。

1.2.6 Transwell與中和抗體實(shí)驗(yàn) Transwell上下小室間的通透膜孔徑為0.4μm,可允許細(xì)胞因子自由通過(guò),而Tregs不能自由通過(guò)。實(shí)驗(yàn)分為六組:①ox-LDL誘導(dǎo)組（noT組）:HUVECs+50mg/Lox-LDL;②CD4+CD25+T細(xì)胞組（CC組）:HUVECs+CD4+CD25+T細(xì)胞+anti-CD3mAbs+50 mg/L ox-LDL;③Transwell實(shí)驗(yàn)組（TW組）:下室中種入HUVECs,上室中種入CD4+CD25+T細(xì)胞+anti-CD3mAbs。④anti-IL-10組:下室中種入HUVECs,上室中種入CD4+CD25+T細(xì)胞+anti-CD3mAbs+anti-IL-10 mAbs;⑤anti-TGF-β組:下室中種入 HUVECs,上室中種入CD4+CD25+T細(xì)胞 +anti-CD3 mAbs+anti-TGF-β mAbs;⑥anti-IL-10+anti-TGF-β組:下室中種入HUVECs,上室中種入 CD4+CD25+T細(xì)胞+anti-CD3 mAbs+anti-IL-10 mAbs+anti-TGF-βmAbs。48小時(shí)后,移走上室,下室中加入50mg/L ox-LDL。各組細(xì)胞均置5%CO2、37℃孵箱,培養(yǎng) 24小時(shí)后收獲HUVECs測(cè)定VCAM-1的表達(dá),收集上清液測(cè)定MCP-1、IL-6的量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以上各組實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)三次,結(jié)果均用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間數(shù)據(jù)處理根據(jù)方差齊性分析的結(jié)果,進(jìn)一步使用S-N-K檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的比較,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制 HUVECs VCAM-1、MCP-1、IL-6表達(dá)

2.1.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制HUVECs VCAM-1、MCP-1、IL-6蛋白水平的表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)（圖1A）和ELISA（圖1B）表明:和 noT組及25-組相比,25+組VCAM-1（P＜0.001）、MCP-1（P＜0.01）、IL-6（P＜0.01）蛋白水平的表達(dá)均顯著下降。

2.1.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制HUVECs VCAM-1、MCP-1、IL-6mRNA水平的表達(dá) 與noT組和25-組相比,25+組細(xì)胞 VCAM-1（P＜0.05）、MCP-1（P＜0.01）、IL-6（P＜0.01）mRNA水平的表達(dá)顯著下調(diào)（圖2）。

圖1 Tregs抑制HUVECs VCAM-1、MCP-1和IL-6蛋白表達(dá)Fig.1 Tregs down-regulate protein expression of VCAM-1,MCP-1 and IL-6 in HUVECs im paired by ox-LDL

圖2 Tregs抑制HUVECs VCAM-1、MCP-1和 IL-6 mRNA表達(dá)Fig.2 Tregs down-regulate mRNA expression of VCAM-1,MCP-1 and IL-6 in HUVECs im paired by ox-LDL

圖3 Tregs抑制HUVECs VCAM-1,MCP-1和IL-6的表達(dá)依賴細(xì)胞直接接觸與細(xì)胞因子Fig.3 Tregs mediated suppression of HUVECs VCAM-1,MCP-1 and IL-6 expression requires both cell contact and solub le factors

2.2 Tregs對(duì)HUVECs的抑制作用依賴于細(xì)胞直接接觸和細(xì)胞因子 與noT組相比,CC組HUVECs VCAM-1表達(dá)下降79.4%（P＜0.001）;與noT組相比,TW組HUVECs VCAM-1表達(dá)下降40.4%（P＜0.01）,Tregs對(duì)HUVECs的抑制作用可被Transwell小室,anti-IL-10 mAbs和或anti-TGF-βmAbs部分逆轉(zhuǎn)（圖 3A）。同樣,Transwell小室、anti-IL-10mAbs和或anti-TGF-βmAbs可部分逆轉(zhuǎn)Tregs對(duì)MCP-1與 IL-6表達(dá)的抑制作用（圖3B）。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生是血管局部產(chǎn)生的一種慢性炎性增生反應(yīng),內(nèi)皮細(xì)胞受損和功能障礙是其早期重要的病理生理變化[1]。

正常情況下,覆蓋于血管的內(nèi)皮細(xì)胞可以阻止白細(xì)胞粘附于血管壁。然而,AS的觸發(fā)因素如ox-LDL可刺激內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)粘附分子如VCAM-1,促進(jìn)炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞粘附于受損的血管壁。同時(shí)受損的內(nèi)皮細(xì)胞可分泌趨化因子,如MCP-1,促進(jìn)單核細(xì)胞或T細(xì)胞以滲出的方式透過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞層進(jìn)入內(nèi)皮下,參與炎癥反應(yīng)[6,7]。而IL-6則可以刺激這一炎癥反應(yīng)中所有相關(guān)急性期蛋白的合成并可對(duì)凝血瀑布、內(nèi)皮細(xì)胞及脈管系統(tǒng)的其他組分產(chǎn)生影響[8]。提示VCAM-1、MCP-1及IL-6等炎性因子在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用。與既往的研究一致,本實(shí)驗(yàn)證實(shí),在ox-LDL刺激下,HUVECs可大量表達(dá)上述炎性相關(guān)因子。

越來(lái)越多的研究表明,Tregs在調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)和發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Tregs既可抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞或B細(xì)胞,也可抑制天然免疫系統(tǒng)中的單核巨噬細(xì)胞,樹(shù)突狀細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的功能[5,9-14]。但Tregs是否抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子的表達(dá)目前尚無(wú)研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HUVECs與Tregs共培養(yǎng)24小時(shí),HUVECs炎性因子VCAM-1、MCP-1及IL-6表達(dá)顯著被抑制,說(shuō)明Tregs除了抑制免疫炎性細(xì)胞的功能外,其還可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的分泌功能,從而發(fā)生抑制AS的作用。

Tregs發(fā)生免疫調(diào)節(jié)的確切機(jī)制尚存爭(zhēng)議,有的報(bào)道認(rèn)為其調(diào)節(jié)功能依賴于細(xì)胞直接接觸;也有報(bào)道認(rèn)為其調(diào)節(jié)功能是細(xì)胞因子介導(dǎo)[15,16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Tregs與HUVECs共培養(yǎng)后炎性因子如VCAM-1的表達(dá)下降79.4%;而用Transwell小室阻斷Tregs與HUVECs直接接觸后,VCAM-1的表達(dá)只下降40.4%,說(shuō)明Tregs對(duì)HUVECs的抑制作用部分依賴于細(xì)胞直接接觸。在用Transwell小室阻斷Tregs與HUVECs直接接觸的同時(shí),加入anti-IL-10/anti-TGF-β中和抗體,Tregs對(duì)HUVECs的抑制作用進(jìn)一步被逆轉(zhuǎn),說(shuō)明此抑制作用也有抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β的參與。

本實(shí)驗(yàn)表明,Tregs可抑制ox-LDL誘導(dǎo)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子如VCAM-1、MCP-1、IL-6的表達(dá);此作用機(jī)制可能與Tregs分泌抑制性細(xì)胞因子及與內(nèi)皮細(xì)胞直接接觸抑制有關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)不僅有助于闡明Tregs在AS發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用,而且為AS的防治提供了一條新的途徑。

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[收稿2010-06-11 修回2010-07-13]

（編輯 倪 鵬）

CD4+CD25+regulatory T cellsmodulate oxidized low density lipoprotein mediated VCAM-1,MCP-1 and IL-6 expression in human umbilical vein endothelial cells

HEShao-Lin,LIDa-Zhu,LIMing,MAXu-Ming,LINJing,CHANGWei,ZHAOHui.InstituteofCardiology,Union Hospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

Objective:To investigate the effects of CD4+CD25+regu latory T cells（Tregs）on oxidized low-density lipoprotein（ox-LDL）-mediated VCAM-1,MCP-1 and IL-6 expression in human umbilical vein endothelial cells（HUVECs）.Methods:HUVECswere incubated alone（noT）,with Tregs（25+）,or CD4+CD25-T cells（25-）in the presence ofanti-CD3mAbs for48 h,then were stimulatedwith ox-LDL for an additional 24 h.Flow cytometry and ELISA were used tomeasure the expression of inflammatory cytokines like vascu lar cell adhesionmolecule-1（VCAM-1）,monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）and interleukin-6（IL-6）in HUVECs responding toox-LDL,respectively.Transwell experimentswere carried to investigate whether suppression of HUVECs inflammatory cytokine expression depended on cell contactor soluble factors.Results:The protein levels of inflammatory cytokines expression in HUVECswere determined by Flow cytometry or ELISA,which showed a significant reduction of inflammatory cytokines（VCAM-1:13.5%±4.0%;MCP-1:16.6±2.0 ng/m l;IL-6:1.9±0.8 ng/ml）in 25+system compared with that in noT system（VCAM-1:57.6%±5.2%;MCP-1:42.4±5.8 ng/m l;IL-6:8.8±1.4 ng/m l）or 25-system（VCAM-1:58.1%±7.1%;MCP-1:46.7±4.0 ng/ml;IL-6:9.3±1.7 ng/ml）.The similar effects of Tregs on themRNA levels of inflammatory cytokineexpression in HUVECswereobtained.Moreover,mechanistic studies revealed that Tregs-mediated suppressionof the HUVECs response to ox-LDL required both cell contact and soluble factors.Conclusion:Tregs are able to inhibit the inflammatory cytokines like VCAM-1,MCP-1 or IL-6 response of HUVECs to ox-LDL,which depends on cell contact aswell as soluble factors.

CD4+CD25+Regu latory T cells;Human umbilical vein endothelial cells;Oxidized Low-Density Lipoprotein;Inflammatory cytokines;Transwell

R392.12

A

1000-484X（2010）12-1064-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.002

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.30670855）

何少林（1983年-）,男,碩士,主要從事冠心病發(fā)癥機(jī)制及其診斷與治療研究,E-mail:wskg1982@yahoo.com.cn;

及指導(dǎo)教師:李大主（1963年-）,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事冠心病發(fā)病機(jī)理及其診斷與治療研究,E-mail:lidazhuhp@sohu.com。

·遺傳免疫學(xué)·