戴志兵 胡四海 劉清南 陳 敏 王玉峰 張愉快 余敏君 朱翠明 李忠玉 陸春雪

（南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所,衡陽(yáng) 421001）

抗淋病LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)免疫應(yīng)答的研究①

戴志兵 胡四海 劉清南②陳 敏 王玉峰 張愉快 余敏君 朱翠明 李忠玉 陸春雪

（南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所,衡陽(yáng) 421001）

目的:初步探討抗淋病LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯(lián)合免疫的免疫增強(qiáng)效應(yīng),為研制抗淋病疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:大量制備核酸疫苗（pcDNA3.1（-）/ltB-porB）及重組蛋白疫苗（rLTB-PorB）;通過(guò)鼻飼途徑將核酸疫苗和蛋白疫苗采用核酸初免-蛋白加強(qiáng)（DNA prime-p rotein boost）聯(lián)合免疫以及分別單獨(dú)免疫雌性BALB/c小鼠,同時(shí)設(shè)PBS及空質(zhì)粒（pcDNA3.1（-））對(duì)照組,檢測(cè)各組體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果:免疫后第56天,聯(lián)合免疫組小鼠生殖道sIgA A450（1.083±0.179）、血清IgGA450（1.023±0.116）、脾淋巴細(xì)胞誘生的IL-4[（357.58±34.44）/pg/m l]和IFN-γ[（261.85±29.92）/pg/m l]水平均明顯高于各對(duì)照組（P＜0.01）,小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率（SI:2.12±0.29）較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05）;核酸疫苗組、蛋白疫苗組和聯(lián)合免疫組血清IgG亞類IgG2a/IgG1比值分別為1.678、0.455和0.693。結(jié)論:LTB-PorB核酸疫苗和蛋白疫苗聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平明顯優(yōu)于單獨(dú)的核酸疫苗組和蛋白疫苗組,且以誘導(dǎo)Th2傾向性免疫應(yīng)答為主。

淋病;孔蛋白B;大腸桿菌不耐熱腸毒素 B亞單位;核酸疫苗;蛋白疫苗;聯(lián)合免疫

淋球菌是引起淋病的病原菌,淋病是我國(guó)目前發(fā)病人數(shù)最多的性傳播疾病,感染淋球菌還可增加HIV傳播的危險(xiǎn)性[1]。如何有效控制和預(yù)防淋病,成為全世界普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題,而研制出有效的疫苗,是預(yù)防和控制淋病的關(guān)鍵。淋球菌孔蛋白B（Porin B,PorB）是最具潛力的淋病疫苗候選抗原之一,大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（B subunitof Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LTB）是一種有效的粘膜佐劑[2],本課題組將二者結(jié)合構(gòu)建LTBPorB融合基因的原核及真核表達(dá)載體。前期研究工作表明,單一LTB-PorB核酸疫苗免疫小鼠后能誘導(dǎo)一定水平的細(xì)胞免疫,單一LTB-PorB蛋白疫苗能誘導(dǎo)一定水平的體液免疫,但二者單獨(dú)免疫均難以同時(shí)誘導(dǎo)高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。目前采用不同類型的疫苗聯(lián)合免疫,如核酸初免-蛋白加強(qiáng)免疫（DNA prime-protein boost）策略被認(rèn)為能有效提高疫苗的免疫效果[3]。本研究采用抗淋病LTBPorB核酸疫苗與蛋白疫苗聯(lián)合鼻飼免疫雌性BALB/c小鼠,探討其能否同時(shí)增強(qiáng)特異性體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,為研制高效抗淋病疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pcDNA3.1（-）、pcDNA 3.1（-）/ltB-porB的E.coliJM109重組克隆菌、pET-30a、pET-30a/ltB-porB的E.coliBL21重組表達(dá)菌均由本室保存;PorB蛋白由本室提供;SPF級(jí)4～6周雌性BALB/c小鼠購(gòu)自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒（去內(nèi)毒素）購(gòu)自O(shè)MEGA公司;Ni-NTA6×His親和層析純化試劑盒購(gòu)自Qiagen公司;一抗:兔抗淋球菌血清和兔抗霍亂弧菌腸毒素（Choleratoxin,CT）血清分別購(gòu)自Abcam和Sigma公司;二抗:HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG。gG1、IgG2a和sIgA分別購(gòu)自Abcam和Sigma公司;Detoxi-GelTM內(nèi)毒素去除膠購(gòu)自Thermo Scientific公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 核酸疫苗及蛋白疫苗的制備 將本室保存的包含pcDNA3.1（-）、pcDNA3.1（-）/ltB-porB的E.coliJM109重組克隆菌擴(kuò)增培養(yǎng),提取質(zhì)粒經(jīng)PCR和BamHⅠ與HindⅢ雙酶切鑒定正確后,去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒大量提取真核質(zhì)粒,核酸蛋白定量分析儀測(cè)定濃度后,調(diào)整核酸濃度為2 500μg/ml。將本室保存的包含pET-30a、pET-30a/ltB-porB的E.coliBL21重組表達(dá)菌擴(kuò)增培養(yǎng),對(duì)溫度、IPTG和時(shí)間等誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行系列摸索優(yōu)化后,表達(dá)并獲得包涵體蛋白。對(duì)表達(dá)后重組蛋白（rLTB-PorB）分別以兔抗淋球菌血清為一抗,兔抗CT血清（LT與CT具有80%以上的同源性且免疫學(xué)性質(zhì)十分相似,可用兔抗CT血清代替兔抗LT血清[4]）為一抗;HRP標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗,按文獻(xiàn)[5]操作,行Western blot鑒定后大量誘導(dǎo)表達(dá),Ni-NTA親和層析純化柱pH梯度洗脫法純化蛋白并通過(guò)尿素梯度透析復(fù)性;去除重組蛋白內(nèi)毒素后測(cè)定蛋白濃度并調(diào)整蛋白濃度為1 250 μg/ml。

1.2.2 動(dòng)物免疫 將75只4～6周雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成A、B、C、D、E 5組,每組 15只:A組（PBS對(duì)照組）、B組（空質(zhì)粒 pcDNA3.1（-）對(duì)照組）、C組（核酸疫苗pcDNA3.1（-）/ltB-porB組）、D組（蛋白疫苗rLTB-PorB組）、E組（聯(lián)合免疫 pcDNA3.1（-）/ltB-porB+rLTB-PorB組）;PBS 40 μl/次、pcDNA3.1（-）及核酸疫苗100μg/次、蛋白疫苗50μg/次,各組均于0、14、28、42天采用鼻飼途徑免疫 4次（聯(lián)合免疫組0、14天為核酸疫苗,28、42天為蛋白疫苗）。

1.2.3 免疫小鼠標(biāo)本的收集 于0、14、28、42、56天收集小鼠生殖道灌洗液100μl;收集小鼠尾靜脈血50～80μl并分離血清,所有標(biāo)本于-20℃保存;末次免疫結(jié)束后14天（第56天）,無(wú)菌分離各組小鼠脾淋巴細(xì)胞。

1.2.4 小鼠生殖道粘膜sIgA的檢測(cè) 用重組蛋白PorB抗原包被ELISA板,以各次收集的小鼠生殖道灌洗液為一抗,以酶標(biāo)羊抗鼠sIgA為二抗,間接ELISA法檢測(cè)PorB特異性sIgA水平。

1.2.5 血清總IgG和亞類IgG1、IgG2a的檢測(cè) 用重組蛋白PorB抗原包被ELISA板,以各次收集的小鼠血清為一抗,以酶標(biāo)羊抗鼠IgG為二抗,間接ELISA法檢測(cè)PorB特異性IgG水平;以末次免疫后14天（第56天）小鼠血清為一抗,分別以酶標(biāo)羊抗鼠IgG1、IgG2a為二抗,間接ELISA法檢測(cè)PorB特異性IgG1、IgG2a 水平 。

1.2.6 脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的檢測(cè) 末次免疫后14天（第56天）常規(guī)方法無(wú)菌分離各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至6×106m l-1,加入24孔培養(yǎng)板中,1m l/孔;每組的每個(gè)培養(yǎng)孔中加入PorB抗原 10μg,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48小時(shí),小心吸出上清,以ELISA試劑盒分別檢測(cè)上清中的IFN-γ、IL-4的水平,具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.7 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 末次免疫后14天（第56天）常規(guī)方法無(wú)菌分離各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106m l-1,加入96孔培養(yǎng)板中,200μl/孔;每只小鼠脾細(xì)胞重復(fù)8孔,其中4孔為空白對(duì)照組,不加抗原;另4孔為實(shí)驗(yàn)組,每孔加入 PorB抗原 2μg,混勻后,置 37℃、5%CO2培養(yǎng)48小時(shí)。于終止培養(yǎng)前4小時(shí)每孔加入5 mg/m l的噻唑藍(lán)（MTT）20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清,每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl,震蕩溶解15分鐘,570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的A570值。根據(jù)刺激指數(shù)（SI）大小來(lái)判斷增殖程度。SI=試驗(yàn)組平均A570值/對(duì)照組平均A570值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析?？贵w水平、脾細(xì)胞刺激指數(shù)及細(xì)胞因子水平以±s表示,組間均數(shù)的比較采用方差分析,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 核酸疫苗及蛋白疫苗的鑒定 本室保存的pcDNA3.1（-）/ltB-porB經(jīng)PCR和BamHⅠ與HindⅢ雙酶切均能得到預(yù)期目的條帶（圖1）。Western blot結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pET-30a/ltB-porB表達(dá)純化產(chǎn)物（rLTB-PorB）與兔抗淋球菌血清和兔抗CT血清均能發(fā)生特異性反應(yīng),均在預(yù)期位置出現(xiàn)單一特異性目的條帶,而陰性對(duì)照組則沒(méi)有特異性條帶（圖2、3）。

圖1 真核重組載體的PCR和酶切鑒定圖譜Fig.1 PCR of eukaryotic recombinant and digested products with Bam HⅠ and H indⅢ

圖2 rLTB-PorB的W estern blot鑒定（以兔抗淋球菌血清為一抗）Fig.2 Analysis of rLTB-PorB by W estern b lot（with rabbit serum of anti-Neisseria gonorrhoeae）

2.2 小鼠生殖道粘膜抗PorB特異性sIgA的檢測(cè)PorB蛋白作為檢測(cè)用抗原,包被 ELISA板,間接ELISA 法對(duì)0、14 、28、42、56天收集的小鼠生殖道灌洗液中的sIgA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:在4次不同時(shí)間的免疫中,C組（pcDNA3.1（-）/ltB-porB）、D組（rLTB-PorB）、E組（pcDNA3.1（-）/ltB-porB+rLTB-PorB）sIgA水平呈上升趨勢(shì),其中C組第 56天A450達(dá)0.542±0.040,效價(jià)高達(dá) 1∶320;D 組第 56 天A450達(dá)0.702±0.053,效價(jià)高達(dá)1∶1 280;E組第56天A450達(dá)1.083±0.179,效價(jià)高達(dá)1∶2 560;三組 sIgA 水平明均顯高于A 組（PBS組,A450:0.132±0.013）、B組（pcDNA 3.1（-）組,A450:0.127±0.025）,且 E組明顯高于C、D組（P＜0.01）,見(jiàn)圖4,結(jié)果說(shuō)明誘導(dǎo)特異性粘膜免疫（sIgA）的水平,聯(lián)合免疫組＞蛋白疫苗組＞核酸疫苗組。

圖3 rLTB-PorB的Western blot鑒定（以兔抗CT血清為一抗）Fig.3 Analysis of rLTB-PorB by Western blot（with rabbit serum of anti-CT）

圖4 鼻飼小鼠生殖道灌洗液抗PorB特異性sIgA水平Fig.4 sIgA levels of PorB in five intranasally immunized groups

圖5 鼻飼小鼠血清抗PorB特異性IgG抗體水平Fig.5 IgG levels of PorB in five intranasally immunized groups

圖6 各組免疫小鼠IgG1、IgG2a水平Fig.6 IgG1 and IgG2a levels of PorB in five intranasally immunized groups

2.3 小鼠血清抗PorB特異性IgG的檢測(cè) PorB蛋白作為檢測(cè)用抗原,包被ELISA板,間接ELISA法對(duì)0、14、28、42、56天收集的小鼠血清中的 IgG進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:在4次不同時(shí)間的免疫中,C、D、E組 IgG水平呈上升趨勢(shì),其中C組第56天A450達(dá)0.541±0.054,效價(jià)高達(dá)1∶1 280;D組第42天達(dá)最高,A450為0.772±0.091,效價(jià)高達(dá)1∶5 120;E組第56天A450達(dá)1.023±0.116,效價(jià)高達(dá)1∶20 480;三組 IgG 水平明均顯高于A組（A450:0.160±0.014）、B組（A450:0.151±0.037）,且E組明顯高于C、D組（P＜0.01）,見(jiàn)圖5,結(jié)果說(shuō)明誘導(dǎo)特異性血清IgG的水平,聯(lián)合免疫組＞蛋白疫苗組＞核酸疫苗組。

2.4 小鼠血清抗PorB特異性IgG1、IgG2a的檢測(cè)PorB蛋白作為檢測(cè)用抗原,包被 ELISA板,間接ELISA法對(duì)末次免疫后14天（第56天）收集的小鼠血清中的 IgG1、IgG2a進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:C組IgG1、IgG2a A450分別為0.345±0.054、0.579±0.055,IgG2a/IgG1為 1.678;D組 IgG1、IgG2a A450分別為0.789±0.202、0.359±0.080,IgG2a/IgG1為0.455,結(jié)果表明核酸疫苗組以誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答為主,而蛋白疫苗組以誘導(dǎo)Th2型應(yīng)答為主;E組IgG1、IgG2a A450分別為 0.950±0.184、0.658±0.173,IgG2a/IgG1為0.693,結(jié)果表明聯(lián)合免疫組IgG2a和IgG1水平較C組或D組均有較大幅度升高,其中IgG1亞類升高的程度更為顯著,且C、D、E 、各組IgG1、IgG2a明顯高于A 組（A450:0.086±0.016、A450:0.071±0.019）、B 組（A450:0.093 ±0.013、A450:0.121±0.021,P＜0.01）,見(jiàn)圖6。

表1 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（SI）及鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ、IL-4含量（pg/m l）Tab.1 Stimulation index,IFN-γand IL-4（pg/m l）in cultured supernatant of sp leen cells from immunizedm ice

2.5 MTT比色法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng) 小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PorB蛋白刺激后的結(jié)果表明:C、D、E各組刺激指數(shù)（SI）明顯高于A組、B組（P＜0.01）;且E組明顯高于C、D組（P＜0.05）;C組亦明顯高于D組（P＜0.05）,見(jiàn)表1,說(shuō)明小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)PorB蛋白刺激的增值能力,聯(lián)合免疫組＞核酸疫苗組＞蛋白疫苗組。

2.6 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ,IL-4含量檢測(cè) 按照說(shuō)明書(shū)建立IFN-γ、IL-4標(biāo)準(zhǔn)方程,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)結(jié)果顯示:C、E兩組IFN-γ含量明顯高于A、B、D組（P＜0.01）,且E組明顯高于C、D組（P＜0.01）,但D組與A、B組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）,見(jiàn)表1,說(shuō)明小鼠脾淋巴細(xì)經(jīng)PorB蛋白刺激誘導(dǎo)的IFN-γ水平,聯(lián)合免疫組＞核酸疫苗組＞蛋白疫苗組,但蛋白疫苗組未誘生出高水平的IFN-γ。C、D、E、各組 IL-4含量明顯高于A 組、B組（P＜0.01）,且E組明顯高于C、D組（P＜0.01）,D組亦明顯高于C組（P＜0.01）,見(jiàn)表1,說(shuō)明小鼠脾淋巴細(xì)經(jīng)PorB蛋白刺激誘導(dǎo)的IL-4水平,聯(lián)合免疫組＞蛋白疫苗組＞核酸疫苗組。

3 討論

DNA疫苗一經(jīng)問(wèn)世,就發(fā)現(xiàn)其可以誘發(fā)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,特別是在誘導(dǎo)CTL免疫應(yīng)答方面是其它疫苗所不能比擬的。然而,在實(shí)際應(yīng)用中,常因體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率欠佳等原因,核酸疫苗所激發(fā)的免疫應(yīng)答強(qiáng)度相對(duì)較弱,尤其在大動(dòng)物以及人體內(nèi)不足以引起足夠的免疫保護(hù)效果[6]。用基因工程構(gòu)建的重組蛋白疫苗一般均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗體,但其誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平常顯不足,保護(hù)效果有限[7,8],究其原因,可能與重組蛋白疫苗主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th2傾向性免疫應(yīng)答有關(guān)。Zhu等[9,10]在淋球菌疫苗的研究中發(fā)現(xiàn)用重組蛋白PorB免疫BALB/c小鼠后,產(chǎn)生了高水平的體液免疫,但其誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫卻相對(duì)不足;PorB核酸疫苗誘發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答相對(duì)較強(qiáng)而體液免疫應(yīng)答相對(duì)較弱。

目前,旨在提高疫苗免疫效果的方法有多種,其中將不同類型的疫苗采用初免-加強(qiáng)（Prime-Boost）策略是研究較多的一種方法。核酸疫苗和蛋白疫苗在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫方面各有優(yōu)勢(shì),一般認(rèn)為核酸疫苗以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答為主,蛋白疫苗以誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答為主[11]。研究者們認(rèn)為采用核酸疫苗與蛋白疫苗聯(lián)合免疫,發(fā)揮兩種疫苗在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的不同優(yōu)勢(shì),可增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的效果。近年來(lái),在血吸蟲(chóng)病、布魯桿菌病、瘧疾、弓形蟲(chóng)病、日本腦炎、結(jié)核病、AIDS等疫苗的研究中發(fā)現(xiàn),核酸疫苗初免后,繼而用相應(yīng)蛋白疫苗加強(qiáng)免疫,其免疫應(yīng)答水平和保護(hù)性免疫效果均較單一核酸疫苗或單一蛋白疫苗增高[12-14]。

本研究采用LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗通過(guò)鼻飼途徑聯(lián)合免疫雌性BALB/c小鼠,初步探討經(jīng)核酸初免-蛋白加強(qiáng)（DNA prime-protein boost）聯(lián)合免疫后對(duì)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用。結(jié)果顯示:經(jīng)4次免疫（聯(lián)合免疫組第1、2次為核酸疫苗,第3、4次為蛋白疫苗）后,核酸疫苗組、蛋白疫苗組和聯(lián)合免疫組小鼠的體液免疫及細(xì)胞免疫水平均明顯高于PBS及pcDNA3.1（-）對(duì)照組（P＜0.01）。核酸疫苗組在免疫后56天誘生了較高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答:脾淋巴細(xì)胞誘生的 IFN-γ為175.70±23.68 pg/m l,脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)（SI）為1.82±0.15;蛋白疫苗組誘生了較高水平的體液免疫應(yīng)答:免疫后42天血清IgG A450為0.772±0.091,免疫后第56天生殖道sIgA A450為0.702±0.053,脾淋巴細(xì)胞誘生的IL-4為251.90±62.14 pg/m l;聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答水平均明顯高于核酸疫苗組或蛋白疫苗組（P＜0.01或P＜0.05）:免疫后56天生殖道sIgA A450為1.083±0.179,血清IgGA450為1.023±0.116,IL-4為357.58±34.44 pg/m l;IFN-γ為 261.85±29.92 pg/m l,SI為 2.12±0.29。此外,檢測(cè)血清IgG亞類,可以監(jiān)測(cè)機(jī)體免疫應(yīng)答類型的變化,IgG2a可反映Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答水平,IgG1可反映Th2型體液免疫應(yīng)答水平。本研究對(duì)免疫后56天各組小鼠血清IgG1、IgG2a的檢測(cè)顯示:核酸疫苗組IgG2a/IgG1比值（1.678）遠(yuǎn)大于蛋白疫苗組（0.455）,結(jié)合SI、IFN-γ、sIgA、IgG 和 IL-4水平,初步表明LTB-PorB核酸疫苗主要誘導(dǎo)Th1型傾向性細(xì)胞免疫應(yīng)答,而蛋白疫苗主要誘導(dǎo)Th2型傾向性體液免疫應(yīng)答;聯(lián)合免疫組IgG2a和IgG1水平較核酸或蛋白疫苗組均有較大幅度升高,其中IgG1亞類升高的程度更為顯著,IgG2a/IgG1比值為0.693,IgG2a/IgG1 比值結(jié)合SI、IFN-γ、sIgA、IgG 和IL-4水平,初步表明聯(lián)合免疫組（DNA prime-protein boost）與單一核酸或蛋白疫苗組比較,能同時(shí)促進(jìn)Th1型和Th2型免疫應(yīng)答,且以誘導(dǎo)Th2傾向性免疫應(yīng)答為主,與Juliana等[15]的結(jié)果基本一致。

核酸-蛋白疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制較為復(fù)雜,目前尚無(wú)明確定論。核酸-蛋白聯(lián)合免疫方法作為一種有希望增強(qiáng)疫苗免疫應(yīng)答的策略,還需進(jìn)一步探索和完善?？沽懿∶庖咧饕獮轶w液免疫,尤其是粘膜免疫。本研究LTB-PorB核酸疫苗與蛋白疫苗通過(guò)粘膜途徑聯(lián)合免疫,所誘導(dǎo)的體液免疫（包括特異性IgG和sIgA）和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平均明顯優(yōu)于單一的核酸或蛋白疫苗,且以誘導(dǎo)Th2傾向性免疫應(yīng)答為主,該研究結(jié)果可為研制高效抗淋病疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 UnemoM,PalmerHM,Blackmore Tetal.Global transmissionofprolyliminopeptidase-negative Neisseriagonorrhoeaestrains:implications for changes in diagnostic strategies[J].Sex Transm Infect,2007;83（1）:47-51.

2 PizzaM,GiulianiM M,Fontana M Retal.Mucosal vaccines:non toxic derivativesof LT and CT asmucosal adjuvants[J].Vaccine,2001;19（17-19）:2534-2541.

3 Ramsay A J,KentS J,Strugnell RAetal.Genetic vaccination strategies for enhanced cellular,humoral andmucosal immunity[J].Immunol Rev,1999;171:27-44.

4 Spangler BD.Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin[J].Microbiol Rev,1992;56（4）:622-647.

5 Sambrook J,Russell DW.黃培堂譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第 3版.北京:科學(xué)出版社,2002:1723-1726.

6 Zhengrong Cui.DNA vaccine[J].AdvGenet,2005;54:257-289.

7 戴志兵,胡四海,陳 敏etal.淋球菌porB和大腸桿菌ltB融合基因的構(gòu)建、表達(dá)及其免疫活性[J].微生物學(xué)報(bào),2010;50（4）:517-523.

8 吳 丹,王慶敏,陳蕊雯etal.豬囊尾蚴抗原 cC1 DNA疫苗和蛋白質(zhì)疫苗聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004;25（1）:34-36.

9 ZhuW,Thomas C E,Chen C Jetal.Comparison of immune responses to gonococcal PorB delivered as outermembrane vesicles,recombinant protein,orVenezuelan equine encephalitis virus replicon partic les[J].Infect Immun,2005;73（11）:7558-7568.

10 Zhu W,Thomas C E,Sparling P F.DNA immunization of mice with a plasmid encoding Neisseria gonorrhea PorB protein by intramuscular injection and epidermal particle bombardment[J].Vaccine,2004;22（5-6）:660-669.

11 戴志兵,胡四海.核酸疫苗與蛋白疫苗的免疫特點(diǎn)及其聯(lián)合免疫的研究進(jìn)展[J].國(guó)際免疫學(xué)雜志,2010;33（2）:89-91,96.

12 Shang L,Liu Q,Liu Wetal.Protection inm ice immunized with a heterologous prime-boost regime using DNA and recombinant pseudorabies expressing TgSAG1 against Toxoplasma gondii challenge[J].Vaccine,2009;27（21）:2741-2745.

13 Li P,Cao R B,Zheng Q Setal.Enhancement of humoral and cellular immunity inm iceagainst Japanese encephalitis virususing aDNA primeprotein boost vaccine strategy[J].Vet J,2010;183（2）:210-216.

14 Wang S,Kennedy JS,West Ketal.Cross-subtype antibody and cellular immune responses induced bya polyvalent DNA prime-protein boostHIV-1 vaccine in healthy human volunteers[J].Vaccine,2008;26（8）:1098-1110.

15 Juliana Cassataro,Carlos A Velikovsky,Laura Brunoetal.Improved immunogenicity of a vaccination regimen combining a DNA vaccine encoding brucellamelitensisoutermembrane protein 31（Omp31）and recombinant omp31 boosting[J].Clinical and Vaccine Immunology,2007;14（7）:869-874.

[收稿2010-01-28 修回2010-05-26]

（編輯 許四平）

Improved immunologic responses of a vaccination regimen combining a DNA vaccine encoding LTB-PorB and recombinant LTB-PorB boosting

DAIZhi-Bing,HUSi-Hai,LIUQing-Nan,CHENMin,WANGYu-Feng,ZHANGYu-Kuai,YUMin-Jun,ZHUCui-Ming,LIZhong-Yu,LUChun-Xue.PathogenicBiologyInstitute,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

Objective:To explore the improved immunological responses induced by a LTB-PorBDNA vaccine prime-p rotein boost immunization regimen.Methods:A LTB-PorBDNA vaccine（pcDNA3.1（-）/ltB-porB）and recombinant LTB-PorB（rLTB-PorB）were prepared.Female BALB/cmicewere inoculatedwith a LTB-PorBDNA vaccine followed by boosting with rLTB-PorB through intranasal immunization at the days 0,14,28,42.Then humoral and cellu llar immunological responses were detected in female BALB/c mice by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）andmethyl thiazolyl tetrazolium（MTT）colorimetric assay.Results:In the DNA vaccine prime-protein boostgroup at day 56,A450of sIgA in genital tract（1.083±0.179）,serum IgGA450（1.023±0.116）,levels of IL-4（357.58±34.44 pg/m l）and IFN-γ（261.85±29.92 pg/ml）,both ofwhichwere inducedwith splenic lymphocytes,were significantly higher than in controls（P＜0.01）,and the stimulation index（2.12±0.29）of splenic lymphocyteswas also significantly higher than in controls（P＜0.05）.The ratios of serum IgG2a/IgG1 in the DNA vaccine group,recombinantp rotein group and the DNA vaccine prime-protein boostgroupwere 1.678,0.455 and 0.693 respectively.Conclusion:The DNA vaccine p rime-protein boost immunization regimen cou ld enhance both humoral and cellullar immunologic responses in BALB/cmice,especially for Th2 humoral immunological response,when comparedwith a LTB-PorBDNA vaccine or a recombinant protein immunization alone.

Gonorrhea;Porin B;LTB;DNA vaccine;Protein vaccine;Combined immunization

R392.12

A

1000-484X（2010）12-1059-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.12.001

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金（30771931）和湖南省教育廳科研基金（08C745）資助項(xiàng)目

②湖南益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,益陽(yáng)413000

戴志兵（1980年-）,男,在讀碩士,主要從事淋球菌疫苗研究,現(xiàn)就職于湖南益陽(yáng)市中心醫(yī)院,E-mail:daizhibing1980@163.com;

及指導(dǎo)教師:胡四海（1957年-）,男,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事抗感染免疫研究,E-mail:hhsshh-518@163.com。

·專題綜述·