李曉艷 倪亞飛 湛曉勤 (瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,瀘州646000)

顆粒酶在大鼠白假絲酵母菌肺炎中的作用探討

李曉艷 倪亞飛 湛曉勤 (瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,瀘州646000)

目的:觀察大鼠白假絲酵母菌肺炎顆粒酶的表達(dá),探討顆粒酶在大鼠白假絲酵母菌肺炎發(fā)展變化過程中可能起到的作用及其意義。方法:選用清潔級健康雄性SD大鼠,隨機分為實驗組與對照組,各組40只。實驗組從氣管注入白假絲酵母菌菌液制備白假絲酵母菌肺炎模型,分別于1、3、7、11天心室腔穿刺抽血,經(jīng)離心后取血清,用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清顆粒酶、并同步檢測血清IFN-γ、II-2水平。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析與統(tǒng)計學(xué)圖表繪制。結(jié)果:白假絲酵母菌肺炎模型組第1、3、7、11天組均有炎癥反應(yīng),Szapiel評分分別為1.70±0.48、3.60±0.70、2.90±0.57、1.30±0.52 (P＜0.05),菌體負(fù)荷數(shù)分別為3.50±1.08、4.60±1.08、1.30±0.48、0.10±0.32(106CFU/ml),(P＜0.05)。白假絲酵母菌肺炎模型組第1、3、7天顆粒酶、IFN-γ、IL-2值較正常對照組增高,兩組存在顯性著差異(P＜0.05)。11天模型組與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。血清顆粒酶表達(dá)與IFN-γ、IL-2水平變化呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.845和0.808均P＜0.05。結(jié)論:顆粒酶在消除大鼠白假絲酵母菌肺炎病原體方面可能起著積極的作用并與IFN-γ、IL-2可能起協(xié)同作用。

白假絲酵母菌;肺炎;顆粒酶

10.3969/j.issn.1000-484X.2010.10.018

隨著廣譜抗生素、皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用,外科介入療法的逐漸增多以及腫瘤放化療的影響,深部真菌尤其肺部真菌感染率呈增長趨勢,在深部真菌感染的病原體中以念珠菌為主,而白假絲酵母菌是念珠菌屬中最常見的病原體[1]。顆粒酶是存在于細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞胞漿顆粒的一組同源性絲氨酸(Serineprotease),是CTL和NK細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用的主要效應(yīng)分子[2]。在本實驗中,同步測定了大鼠白假絲酵母菌肺炎血清顆粒酶和IFN-γ、IL-2的水平,并分析它們表達(dá)的相關(guān)性。旨在探討這些因素對大鼠白假絲酵母菌肺炎不同時期的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級SD雄性大鼠80只, (由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供,體重(150～180克)。隨機分為對照組、模型組(n=40)大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉后固定,在無菌操作下用1 ml注射器從氣管內(nèi)注入白假絲酵母菌菌液0.4 ml(107CFU/ml),對照組注入等量的無菌生理鹽水。分別于1、3、7、11天在無菌條件下氯胺酮腹腔注射麻醉大鼠后開胸,暴露心肺,用5 ml空針右心室采血處死動物各10只。

1.2 組織標(biāo)本制作 取右肺病理標(biāo)本置10%中性甲醛固定24小時后,逐級乙醇脫水,石蠟包埋,切片,片厚5 μ m,制成組織切片,HE染色鏡下觀察肺組織病理改變,并做評分。將大鼠左肺取下,取1 cm×1 cm組織塊無菌條件下剪碎,勻漿后置入沙保培養(yǎng)基計數(shù)菌落數(shù)。

1.3 免疫學(xué)檢測 處死大鼠同時用5 ml空針右心室采血,收集血清,用ELISA檢測顆粒酶、IFN-γ、IL-2的表達(dá),嚴(yán)格按說明書要求進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件處理,以±s表示,采用T檢驗和直線相關(guān)分析方法,P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察 1、3、7天組鏡下可見肺泡間隔明顯增厚,血管擴張、充血明顯,可見多灶性出血,肺泡細(xì)胞增生,大量炎細(xì)胞浸潤,以中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主,部分肺泡上皮脫落,氣管周圍可見大量淋巴細(xì)胞增生,部分肺泡間隔斷裂,肺泡融合,以3天組最明顯,7天組開始減輕。11天組可見部分肺泡間隔增厚,組織充血、水腫及出血不明顯,部分肺泡細(xì)胞增生,見表1。

2.2 肉眼觀察 對照組肺組織呈粉紅色、質(zhì)軟、光滑、無異常發(fā)現(xiàn)、肺組織組無明顯改變。3、7天組大鼠可見肺組織充血水腫,部分被膜下可見點、片狀出血,表面見灰白色點狀病灶,以第3天組為重。第11天組肺組織充血水腫明顯減輕,被膜下未見點狀出血。

2.3 肺組織真菌培養(yǎng) 35℃搖床搖動培養(yǎng)48小時后,沙保培養(yǎng)基上可見大小較均一的白色菌落生長,念珠菌顯色培養(yǎng)基平皿上可見表面光滑圓形,翠綠色菌落,證實為白假絲酵母菌。模型組第1、3、7天組均可見白假絲酵母菌菌落生長,11天組極少量白假絲酵母菌生長,正常對照組培養(yǎng)均無白假絲酵母菌生長,見表2。

2.4 血清學(xué)檢測 大鼠血清顆粒酶的變化:對照組內(nèi)比較,第1、3、7、11天顆粒酶表達(dá)程度無明顯差異(P＞0.05)。模型組內(nèi)比較,LSD-T檢驗組內(nèi)比較3天＞7天＞1天＞11天(均＜0.05)。模型組與對照組比較1、3、7天顆粒酶表達(dá)較正常對照組增高,兩組存在顯著性差異(P均＜0.01)。11天模型組與對照組比較無顯著差異(P＞0.05),詳見表3。

表1 兩組大鼠肺泡炎程度比較(±s)Tab.1 Comparison the inflammation of alveolus between the groups(±s)

表1 兩組大鼠肺泡炎程度比較(±s)Tab.1 Comparison the inflammation of alveolus between the groups(±s)

Note:Compared with normal control group,1)P＜0.05;Compared with 1 d model group,2)P＜0.05.

Groups n The degree of alveolitis(score) 1 d 3 d 7 d 11 d Nor mal control 10 1.00±0.00 1.10±0.32 1.00±0.00 1.20±0.42 Model group 10 1.70±0.481) 3.60±0.701)2) 2.90±0.571)2) 1.30±0.522)

表2 兩組大鼠真菌菌落數(shù)比較(±s,106CFU/ml)Tab.2 Comparison the colony count of lung tissue between the groups(±s,106CFU/ml)

表2 兩組大鼠真菌菌落數(shù)比較(±s,106CFU/ml)Tab.2 Comparison the colony count of lung tissue between the groups(±s,106CFU/ml)

Note:Compared with normal control group,1)P＜0.05;Compared with 1 d model group,2)P＜0.05.

Groups n The colony count of fungi(106CFU/ml) 1 d 3 d 7 d 11 d Nor mal control 10 — — — —Model group 10 3.50±1.071) 4.60±1.081)2) 1.30±0.481)2) 0.10±0.321)2)

表3 兩組大鼠血清顆粒酶濃度測定(±s,pg/ml)Tab.3 The serum concentrations of granzyme in different groups(±s,pg/ml)

表3 兩組大鼠血清顆粒酶濃度測定(±s,pg/ml)Tab.3 The serum concentrations of granzyme in different groups(±s,pg/ml)

Note:Compared with normal control group,1)P＜0.05;Compared with 1 d model group,2)P＜0.05.

Groups n The serum concentrations of Granzyme(pg/ml) 1 d 3 d 7 d 11 d Nor mal control 10 240.10±14.86 239.30±20.31 232.40±17.09 233.06±35.27 Model group 10 356.60±20.441) 546.30±37.891)2) 467.33±32.491)2) 269.66±35.32

表4 兩組大鼠血清IFN-γ濃度測定(±s,pg/ml)Tab.4 The serum concentrations of IFN-γin different groups(±s,pg/ml)

表4 兩組大鼠血清IFN-γ濃度測定(±s,pg/ml)Tab.4 The serum concentrations of IFN-γin different groups(±s,pg/ml)

Note:Compared with normal control group,1)P＜0.05;Compared with 1 d model group,2)P＜0.05.

Groups n The serum concentrations of IFN-γ(pg/ml) 1 d 3 d 7 d 11 d Nor mal control 10 32.55±2.09 33.10±1.47 30.95±1.5 33.45±3.54 Model group 10 37.86±5.241) 55.38±3.171)2) 43.17±4.561)2) 32.23±4.57

表5 兩組大鼠血清IL-2濃度測定(±s,pg/ml)Tab.5 The serum concentrations of IL-2 in different groups(±s,pg/ml)

表5 兩組大鼠血清IL-2濃度測定(±s,pg/ml)Tab.5 The serum concentrations of IL-2 in different groups(±s,pg/ml)

Note:Compared with normal control group,1)P＜0.05;Compared with 1 d model group,2)P＜0.05.

Groups n The serum concentrations of IL-2(pg/ml) 1 d 3 d 7 d 11 d Nor mal control 10 28.80±1.74 30.15±2.07 30.05±1.88 29.18±1.93 Model group 10 32.12±2.851) 45.60±2.161)2) 35.55±1.871)2) 28.74±1.67

圖1 顆粒酶與IFN的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of granzyme and IFN-γ

2.5 大鼠血清IFN-γ、IL-2的變化 對照組內(nèi)比較1、3、7、11天IFN-γ及IL-2表達(dá)程度無明顯差異, (P＞0.05)。模型組內(nèi)比較,LSD-T檢驗組內(nèi)比較3天＞7天＞1天＞11天(P均＜0.05)。模型組與對照組比較,1、3、7天IFN-γ及IL-2表達(dá)較正常對照組增高,兩組存在顯著性差異(P均＜0.01)。11天模型組與對照組比較無顯著差異(P＞0.05),詳見表4、5。2.6 相關(guān)性分析 大鼠血清顆粒酶表達(dá)與血清IFN-γ、IL-2濃度變化的相關(guān)性分析,它們的表達(dá)呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.845和0.808,均P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖1、2。

3 討論

圖2 顆粒酶和IL-2的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of granzyme and IL-2

高等生物的重要免疫防御機制之一,是通過免疫毒性細(xì)胞(主要是CTL和NK細(xì)胞)介導(dǎo),誘發(fā)已病變細(xì)胞(如感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)發(fā)生凋亡來實現(xiàn)?；罨募?xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞清除機體內(nèi)病毒感染細(xì)胞、胞內(nèi)菌的作用途徑主要是穿孔素顆粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞毒途徑和FasL/Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。前者發(fā)生較早,約占細(xì)胞毒60%～70%。后者發(fā)生較晚,約占30%～40%權(quán)重[3]。CTL幾乎完全依賴穿孔素和顆粒酶殺傷靶細(xì)胞和病原體,當(dāng)CTL和NK細(xì)胞受到抗原刺激后,引起細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平升高,促使穿孔素(Perforin, PFN)釋放進(jìn)入細(xì)胞間隙,在Ca2+存在及中性pH條件下,單體形式的PFN能在靶細(xì)胞膜上聚合成內(nèi)徑5～20 nm的貫通孔道,PFN形成的細(xì)胞膜孔道可作為顆粒酶進(jìn)入細(xì)胞的入口[4]。進(jìn)入靶細(xì)胞后的顆粒酶位于細(xì)胞漿隔室中,在這里它對靶細(xì)胞無損害,但是實驗加入純化的PFN后或接受到腺病毒的信號后,顆粒酶可以釋放和轉(zhuǎn)運到細(xì)胞漿和核內(nèi),裂解底物。Anichini等[5]認(rèn)為顆粒酶在體外能非常有效地殺傷胞外結(jié)核桿菌。汪明明等[6]研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞穿孔素和顆粒酶的表達(dá)強度與血清HBV DNA載量呈明顯負(fù)相關(guān),提示穿孔素和顆粒酶的表達(dá)可以反映CTL和NK對HBV DNA的清除能力,穿孔素和顆粒酶的表達(dá)增強有助于機體對病毒的清除。Markaryan等[7]用新生隱球菌研究CD8+T細(xì)胞表達(dá)的顆粒酶活性及調(diào)節(jié)作用,發(fā)現(xiàn)IL-15活化的CD8+T細(xì)胞具有抗新生隱球菌作用,同時表達(dá)顆粒酶上調(diào)。因此顆粒酶是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒顆粒中量最多的一種重要效應(yīng)分子。IFN-γ、IL-2是炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)過程中的重要細(xì)胞因子,它為分子量80 kD以下的糖蛋白,在人體內(nèi)含量極微,在pg水平就可發(fā)揮作用。細(xì)菌、病毒等微生物與物理或化學(xué)因素對機體的損傷都可以激發(fā)IFN-γ、IL-2的產(chǎn)生。許多動物實驗都已經(jīng)證實IFN-γ、IL-2在抗真菌感染中起正向保護(hù)作用,它們能激活巨噬細(xì)胞以抗真菌[8]。

在本試驗中,我們發(fā)現(xiàn)模型組顆粒酶增高貫穿于真菌性肺炎始終,從第1天至第11天都有不同程度的表達(dá),濃度在第3天組達(dá)到高峰,7天組有所回降,11天組明顯回降,而這個動態(tài)的演變過程與鏡下肺的病理改變及細(xì)菌培養(yǎng)是吻合的,鏡下我們可以看到3天組肺組織炎癥改變極度明顯,7天組部分區(qū)域明顯,11天組改善明顯。肺組織細(xì)菌培養(yǎng)48小時:模型組3天、7天組可見大量白假絲酵母菌生長,模型11天組僅見少量真菌生長。正常對照組無白假絲酵母菌生長。實驗表明顆粒酶參與了白假絲酵母菌肺炎的整個過程,其表達(dá)水平的消長與病原體負(fù)荷量及肺部炎癥程度密切相關(guān),分析其原因可能為急性感染期病原體數(shù)量增多,毒力增強,抗原提呈細(xì)胞向CTL提呈抗原相應(yīng)增多,則CTL的的活性增高,CTL分泌顆粒酶增多,顆粒酶隨CTL脫顆粒而出胞,循Perforin在靶細(xì)胞膜所形成的孔道進(jìn)入靶細(xì)胞,通過激活凋亡相關(guān)的酶系統(tǒng)而介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。而感染緩解期及正常對照組CTL活性減弱,顆粒酶的釋放也同時減少。反映了顆粒酶參與體內(nèi)抗感染的免疫過程。由此,我們可以推測顆粒酶在主要依賴細(xì)胞免疫的真菌感染中可能起著重要的作用,且可作為監(jiān)視白假絲酵母菌感染病情的一個指標(biāo)。同時我們的研究發(fā)現(xiàn)顆粒酶、IFN-γ、IL-2在急性感染期早期升高明顯,之后逐漸下降,在大鼠血清顆粒酶表達(dá)與血清抗感染相關(guān)因子IFN-γ、IL-2濃度變化的相關(guān)性分析中,它們的表達(dá)呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.845和0.808,均P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義,它們在抗真菌感染過程中可能起著協(xié)同作用。

綜上所述,我們認(rèn)為,在真菌感染時,一方面,機體啟動細(xì)胞免疫,抗原提呈細(xì)胞向CTL提呈抗原增多,CTL的活性增高,CTL分泌顆粒酶增多,起到殺菌作用;另一方面,IFN-γ、IL-2產(chǎn)生增多,不同的細(xì)胞因子之間形成網(wǎng)絡(luò),相互調(diào)節(jié)產(chǎn)生和發(fā)揮效應(yīng),并可能與顆粒酶密切相關(guān),顆粒酶,IFN-γ、IL-2一起共同參與抗真菌感染過程,在消除病原體方面可能起到相互協(xié)同的作用。

1 Kam L W,Lin J D.Management of systemic candidalinfections in the intensive care unit[J].Am J Health Syst Pharm,2002;59:33-41.

2 潘景軒.細(xì)胞毒T細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷機制研究進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志,1997;13(1):58-62.

3 Natarajan K,Dimasi N,Wang J et al.Structure and function of natural killer cell receptors:multiple molecular solutions to self,nonself discrimination[J].Annu Rev Immunol,2002;20:853-885.

4 Trapani J A.Granzymes:a family of lymphocyte granule serineproteases [J].Genome Biol,2001;2(12):3014.1-3014.7.

5 Anichini A,Scarito A,Molla A et al.Differentiationof CD8+T cells from tumor-invaded and tumor-free lymph nodes of melanoma patients:role of common gamma-chain cytokines[J].J Immunology,2003;171:2134-2141.

6 汪明明,崔速南,劉靚雯 et al.外周血淋巴細(xì)胞穿孔素和顆粒酶在不同乙型肝炎患者中的表達(dá)率比較[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2007;27(9):855-855.

7 Markaryan A,Morozova I,Yu H et al.Purification and characterization of an elastinolytic metalloprotease from Aspergillus fumigatus and immunoelectron microscopic evidence of secretion of this enzyme by the fungus invading the murine lung[J].Infect Immun June,1994;62:2149-2157.

8 徐世豪.腫瘤壞死因子[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,1990;6(15):404-404.

[收稿2010-05-26 修回2010-06-17]

(編輯 倪 鵬)

The role of granzyme in the rats with Monilia albicans pneumonia

LI Xiao-Yan,NI Ya-Fei,ZHAN Xiao-Qin.Department of Respiratory Medicine,the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,China

Objective:To observe the expression of granzyme in ratswithMonilia albicans pneumonia,and to discusse the role and significance of granzyme in the progressand change of ratswith Monilia albicanspneumonia.MethodsEighty male SD ratswere randomly divided into control group and experiment group(n=40each).Experimentalgroupwas instilledwith Monilia albicans from the trachea to prepare bacterial pneumonia of Monilia albicans and ventricle bloodwas taken at 1 d,3 d,7 d,11 d after instillation separately.Granule enzymesin serum were measured by Double-antibody sandwich ABC-ELISA.Andthe same thing,IFN-γ,IL-2was also detected by ELISA.The data were analyzed with SPSS13.0.ResultsInflammatory response was apparently invisible in experimental group of 1 d,3 d,7 d,11 d group.Szapiel Grade was 1.70±0.48,3.60±0.70,2.90±0.57,1.30±0.52(grade),respectively(P＜0.05).The number of bacterial load was 3.50±1.08, 4.60±1.08,1.30±0.48,0.10±0.32(106CFU/ml)respectively(P＜0.05).Granzyme,IFN-γand IL-2 in Monilia albicans pneumonia group at 1 d,3 d,7 dwere higher than in the control group.There were significant differences(P＜0.05).However,at 11-day there was no difference in this two groups(P＞0.05).Serum granzyme had positive correlation with both IFN-γand IL-2 levels.ConclusionGranule enzymesmay play an active role in eliminating pathogens of ratswith Monilia albicans pneumonia and may have synergistic effect with the IFN-γ and IL-2.

Monilia albicans;Pneumonia;Granzyme

R563.1

A

1000-484X(2010)10-0940-04

李曉艷(1984年-),女,在讀碩士,主要從事肺部真菌感染方面的研究,E-mail:lxy2010511@163.com;

及指導(dǎo)教師:湛曉勤(1958年-),女,主任醫(yī)師,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事肺部感染方面的研究, E-mail:zhanxiaoqin06@sina.com。