何 琳，王祿增，鄭志紅

（1.中國醫(yī)科大學實驗動物部 遼寧省實驗動物轉基因重點實驗室，2.中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院 中心實驗室，沈陽 110001）

腫瘤是人類最常見的一種多基因、多因素復雜疾病，其發(fā)生是由于細胞出現(xiàn)異常增殖。以往研究顯示原癌基因和抑癌基因的表達異常對腫瘤發(fā)生起著非常重要的作用，近年來隨著生命科學的進展發(fā)現(xiàn)有些腫瘤組織中較少甚至完全沒有基因突變，而m iRNA表達卻存在異常。有關m iRNA的研究，為更全面深入的了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路。

Dicer是miRNA形成過程中必須的酶。在細胞核內編碼miRNA的基因轉錄成miRNA原初轉錄物（pri-miRNA），pri-miRNA在一種被稱作 Drosha的RNA酶的作用下，剪切為長度約70個核苷酸的前體m iRNA（pre-m iRNA）［1］。pre-m iRNA在Ran-GTP依賴性核質/細胞質轉運蛋白 exprotin-5的作用下，從核內運輸到胞質中［2，3］，最后在Dicer酶作用下剪切為含有20-24個核苷酸長度的雙鏈miRNA，然后雙螺旋解旋，miRNA結合到RNA誘導的沉默復合物（RISC）中形成非對稱RISC復合物而發(fā)揮剪切或抑制翻譯的作用［4］。由此推測，Dicer基因表達異常時可能會引起某些m iRNA表達異常從而引起細胞或組織異常增生，甚至導致腫瘤的形成。為此，作者將Dicer基因穩(wěn)定轉染人胚肺細胞（HELF），制作Dicer基因高表達的細胞模型，通過檢測轉染后HELF細胞增殖能力和侵襲能力的變化來分析Dicer基因在腫瘤發(fā)生中所行使的功能。同時，本實驗也為進一步建立轉基因小鼠模型及在動物水平對Dicer基因功能進行研究提供了一定的實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

pcDNA3.1質粒、pcDNA3.1—Dicer質粒、HELF細胞為本實驗室保存，DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、脂質體轉染試劑 Lipofectamine reagent（Invitrogen）、G418、Trizol （Invitrogen）、RT-PCR 試 劑 盒（Promege）、兔抗人 Dicer多克隆抗體（Imgenex）、MTT（華美公司）、Transwell小室（Falcon）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉染：用含 10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)HELF細胞。培養(yǎng)細胞處于增殖期時，以3×105細胞/孔的密度平鋪于6孔板培養(yǎng)皿上，繼續(xù)培養(yǎng)20～24 h，細胞約長滿孔板底部90％時，用脂質體介導的方法進行轉染，將質粒 pcDNA3.1-Dicer、pcDNA3.1（空載體）分別轉染HELF細胞，按照Lipofectamine plus試劑盒說明進行操作。轉染細胞培養(yǎng)48 h后進行1：7傳代，然后加入G418進行篩選，每3 d換液1次，約10 d后，可見細胞呈單克隆狀生長，挑取實驗組和對照組穩(wěn)定轉染細胞單克隆各100個接種于24孔板中，進行培養(yǎng)。

1.2.2 PCR實驗檢測各轉染細胞株 Dicer基因嵌合情況：酚氯仿法提取細胞基因組DNA進行PCR檢 測，PCR 引 物 序 列：上 游 5′-GGCATT GGGAAGAATCAGCC-3′下 游 5′-ATTGATGTGTC CAATGGCCC-3′，PCR反應條件如下：95℃ 5 m in，94℃ 1 m in，60℃ 1 m in，72℃ 1 m in，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.3 RT-PCR實驗檢測PCR陽性Dicer基因表達情況：提取PCR陽性的細胞總RNA，并用DNA酶處理總RNA；瓊脂糖凝膠電泳確定RNA未降解，紫外分光光度計測定濃度，取1μg RNA，按照RT試劑盒反轉錄為cDNA，進行PCR擴增，PCR引物：上游5′-GGCATTGGGAAGAATCAGCC-3′ 下 游 5′-ATTGATGTGTCCAATGGCCC-3′，PCR反應條件如下：95℃5 m in，94℃1 m in，60℃1 m in，72℃1 m in，從第二步開始循環(huán)30次，最后72℃延伸10 m in，產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測Dicer基因的表達。1.2.4 Western blot實驗檢測 Dicer基因蛋白表達情況：取正常 HELF細胞和 pcDNA3.1轉染組、pcDNA3.1-Dicer轉然組RT-PCR陽性細胞各一株分別分別提取細胞總蛋白，培養(yǎng)細胞加入含有蛋白質酶抑制劑的蛋白裂解液1 m L/瓶，冰上裂解30 min，12 000 r/m in，4℃離心40 m in，吸取上清即為細胞總白質。取總蛋白150μg/孔（20μL），沸水煮10 m in，室溫冷卻15 m in，7％SDS-PAGE分離總蛋白，然后將蛋白質轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（1∶2000稀釋的兔抗人Dicer）置搖床上4℃震蕩孵育過夜，加入相應二抗（1：2000）置搖床上室溫震蕩孵育2 h，ECL顯色，曝光于X光片上。掃描計算灰度值。

1.2.5 MTT實驗檢測 Dicer對細胞增殖能力的影響：將對數生長期的正常HELF細胞和 pcDNA 3.1轉染組、pcDNA 3.1-Dicer轉染組陽性細胞，以每孔3000個細胞分別接種于96孔板中，分別在培養(yǎng)24、48、72、96 h后加入MTT溶液（終濃度為5 mg/m L），37℃、孵育 4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜 150 μL/孔，置振蕩儀上低速震蕩10 m in，以培養(yǎng)液調零，在酶標儀上測定490 nm的光吸收值。每組設8個孔，共重復3次。以時間為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.6 Transwell實驗檢測 Dicer對細胞遷移能力的影響：將pcDNA3.1-Dicer轉染組細胞、pcDNA3.1轉染組細胞和未轉染的 HELF細胞各100 m L（約2.5×104個細胞），加入Transwell系統(tǒng)的上層小室，下室加入含有10％FBS的DMEM 600μL作為趨化因子，置于5％CO2孵箱中、37℃條件下培養(yǎng)22 h，鏡下觀察實驗組細胞已大部分穿過人工基底膜。取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦掉上層小室側未侵襲過去的細胞，將濾膜用4％多聚甲醛固定15 min，蘇木素染核，于100倍顯微鏡下計數上下左右中5個視野的侵襲細胞數，計算平均值。上述實驗重復3次。

2 結果

2.1 PCR檢測結果

用脂質體介導的方法將質粒 pcDNA3.1-Dicer和空載體pcDNA3.1轉染HELF細胞G418篩選后各挑取100個克隆，分別提取細胞基因組DNA，PCR擴增結果顯示，pcDNA3.1轉染組9（9/100）個陽性克隆未能擴增出 Dicer基因片段，而 pcDNA3.1-Dicer轉染組6（6/100）個單克隆成功擴增出487 bp目的基因片段（圖1），說明PCR結果初步鑒定轉染質粒已嵌合于HELF細胞。

2.2 RT-PCR檢測結果

提取PCR陽性的各穩(wěn)定轉染細胞株總RNA，以反轉錄生成的cDNA為模板進行PCR擴增，pcDNA 3.1轉染組未能擴增出 Dicer基因片段，而 pcDNA 3.1-Dicer轉染組有4個細胞株成功擴增出487 bp的目的基因片段（圖2），說明Dicer基因已成功轉染HELF細胞。

2.3 W estern檢測結果

Western 印跡分析顯示與轉染空載體pcDNA3.1的 HELF細胞相比，轉染 pcDNA 3.1-Dicer質粒的HELF細胞中 Dicer蛋白的表達明顯增強，其分子量大小約200 kD（圖3）。各組之間表達差異經統(tǒng)計學分析顯示：轉染空載體 pcDNA 3.1的HELF細胞與轉染pcDNA 3.1-Dicer質粒的HELF細胞之間比較P＜0.05；轉染空載體pcDNA3.1的HELF細胞與正常HELF細胞之間比較P＞0.05，無統(tǒng)計學意義。2.4 M TT檢測結果

圖1 Dicer DNA在轉染HELF細胞中的表達Fig.1 Expression of Dicer DNA in the transfected HELF cells

圖2 Dicer mRNA在穩(wěn)定轉染PCR陽性HELF細胞中的表達Fig.2 Expression of Dicer mRNA in the stably transfected HELF cells

表1 三組細胞在不同時間MTT光吸收值的描述性統(tǒng)計Tab.1 Descriptive statistics of MTT optical absorbance at different times among the cells of the three groups

圖3 Western blot檢測在穩(wěn)定轉染HELF細胞中Dicer蛋白表達Fig. 3 The Dicer protein expression detected by Western blot

轉染 pcDNA 3.1-Dicer質粒的 HELF細胞的MTT光吸收值在48、72、96 h顯著高于 pcDNA 3.1空載體組（P＜0.05），提示將pcDNA 3.1-Dicer質粒轉染HELF后，使HELF細胞生長率逐漸增加，說明Dicer基因表達水平上調能使HELF細胞生長增殖速度加快（圖4，表1）。

圖4 三組細胞不同時間點的MTT光吸收值檢測細胞增殖變化趨勢的差異Fig.4 The MTT optical absorbance at different times to detect the proliferation trend in cells of the three groups

2.5 T rans-well檢測結果

轉染 pcDNA3.1-Dicer質粒的 HELF細胞比轉染空載體pcDNA 3.1的HELF細胞和普通HELF細胞穿透人工重構基底膜的細胞數明顯增多（圖6，見彩插4），用平均穿膜細胞數標化成相對數后進行統(tǒng)計作圖（圖5）。由圖5可見，轉染pcDNA 3.1-Dicer質粒的HELF細胞穿膜細胞數為198.5±4.75，而未轉染組 HELF細胞和轉染空載體 pcDNA3.1的HELF細胞分別為27.50±6.30和26.88±5.24，質粒 pcDNA3.1-Dicer轉染的 HELF細胞與空載體pcDNA3.1轉染的HELF及HELF細胞比較，穿膜細胞數有顯著增多。轉染pcDNA 3.1-Dicer組與未轉染組、轉染體空載體pcDNA3.1組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

圖5 Transwell實驗結果Fig.5 Results of Transwell chamber assay

Dicer是 RNAⅢ家族的成員之一，其定位在14q32.13，主要存在于細胞質，是 miRNA成熟所必需的酶。Dicer與其酶切產物之一miRNA及其他蛋白質形成核酸蛋白復合物在多種生物過程中起調節(jié)作用，包括細胞增殖、分化、凋亡、死亡等。有研究發(fā)現(xiàn)許多疾病的形成尤其是腫瘤的發(fā)生與 Dicer基因表達異常密切相關。研究顯示，在有些腫瘤組織中Dicer基因起到抑癌基因的作用，其表達水平下調，如：在非小細胞肺癌中Dicer基因表達水平下調，引起let-7表達下調，并與預后正相關［5，6］；在卵巢癌中Dicer基因表達水平下調［7］。有些腫瘤組織中Dicer基因起到原癌基因的作用，其表達水平上調，如：在肝癌和前列腺癌中 Dicer基因表達水平上調［8，9］。

根據前人研究結果可以看出Dicer基因在不同的腫瘤中表達水平不一致。為了進一步了解 Dicer基因表達上調在腫瘤細胞異常增殖及侵襲轉移過程中的作用機制，我們應用脂質體介導的轉染方法制備了Dicer基因高表達的細胞模型。通過用MTT實驗繪制生長曲線，發(fā)現(xiàn)轉染 pcDNA 3.1-Dicer質粒的HELF細胞較轉染空載體pcDNA3.1的HELF細胞生長速度明顯加快（P＜0.05），說明Dicer基因表達增加能使HELF細胞生長增殖速度加快，提示Dicer基因表達增加可能會使細胞產生惡性轉化的趨勢；同時本研究將穩(wěn)定轉染的細胞和正常細胞分別接種于Transwell小室的上室，通過在顯微鏡下觀察計數穿過人工重構基底膜的細胞數測定HELF細胞遷移能力的變化，發(fā)現(xiàn)轉染 pcDNA 3.1-Dicer質粒的HELF細胞比轉染空載體pcDNA3.1的HELF細胞和普通HELF細胞穿過人工重構基底膜的細胞數明顯增多（P＜0.05），說明Dicer基因的表達增加能使HELF細胞的體外侵襲和遷移能力有所增強，這些與以往的報道是一致的。有研究顯示Dicer基因定位在人染色體14q32.13，而這一位點正是最常見的引起肺腺癌的突變位點［10］，當 Dicer基因表達增加時，引起該位點突變，從而引起細胞惡性轉化：使細胞增值速度加快，侵襲和遷移能力增加。還有研究顯示Dicer的酶切產物之一m iRNA與人類腫瘤發(fā)生密切相關，在 B細胞淋巴細胞瘤中 Dicer基因表達增加，引起miR-17-92簇 miRNA經常被擴增，He和 O’Donnell等人［11］發(fā)表的論文描述：在 B細胞淋巴瘤中常常有13q31位點的擴增，而在這一擴增區(qū)域的唯一基因就是 Cl3orf25。Cl3orf25基因的第3內含子編碼一個非編碼蛋白的RNA基因，m iR-17-92。He分析了具有13q31擴增的細胞系的191個miRNAs，發(fā)現(xiàn)其中有6個miRNAs的表達增加，其中5個屬于miR-17-92基因簇，研究還發(fā)現(xiàn)許多B細胞淋巴瘤組織 miRNA-17的前體表達增加，并且他們通過對比過表達Myc和miR-17-92miRNA基因的淋巴瘤與僅有Myc過表達的腫瘤細胞進行比較，發(fā)現(xiàn)前者具有更強的增殖能力，說明 m iR-17-92m iRNA簇的過表達與 Myc協(xié)同作用加快了腫瘤的發(fā)生。以上研究結果也說明Dicer基因表達增加，引起具有癌基因功能的miRNA表達上調可能是腫瘤形成的原因之一。但Dicer基因具體的作用機制尚不十分清楚，為此我們將在轉基因小鼠的動物模型上進一步對 Dicer基因的功能及作用機制進行研究。

［1］ Lee Y，Ahn C，Han J，et al.The nuclear RNaseⅢ Drosha initiates microRNA processing［J］.Nature，2003，425：415 -419.

［2］Lund E，Guttinger S，Calado A，et al.Nuclear export of microRNA precursors［J］.Sinence，2004，303：95-98.

［3］ Kidner CA，Martienssen RA.Macro effect of microRNAs in plants［J］.Trends Genet，2003，19：13-16.

［4］ Bartel DP.MicroRNAs：Genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116：281-297.

［5］ Yanaihara N，Cap len N，Bowman E，et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis［J］.Cancer Cell，2006，9：189-198.

［6］ Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435：834-838.

［7］ Merritt WM，Lin YG，Kamat AA，et al.Dicer Drosha and outcomes in patients with ovarian cancer［J］.N Engl J Med，2008，359（25）：2641-2650.

［8］ 王玉蘭，王愛華，陳允碩，等.實時熒光定量RT-PCR檢測原發(fā)性肝細胞癌中Dicer mRNA的表達［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2006，27（8）：842-844.

［9］ Chiosea S，Jelezcova E，Chandran U，et al.Up-regulation of Dicer，a component of the microRNA machinery，in prostate adenocarcinoma［J］.Am J Pathol，2006，169（5）：1812 -1820.

［10］Chiosea S，Jelezcova E，Chandran U，et al.Overexpression of Dicer in precursor lesions of lung adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2007，67：（5）2345-2350.

［11］ He L，Thomson JM，Hemann MT，etal.A microRNA polycistron as a potential human oncogene［J］.Nature，2005，435：828 -833.