張 晟，肖高芳，黃黎珍，那順巴雅爾，賈俊雙，姚志芳，肖 東，顧為望

（南方醫(yī)科大學(xué)1.比較醫(yī)學(xué)研究所暨實驗動物中心；2.腫瘤研究所，廣州 510515）

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細胞；借助慢病毒可將其攜帶的外源基因高效整合進宿主細胞基因組中，外源基因可在細胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達［1］，這些優(yōu)勢是其它病毒介導(dǎo)的外源基因傳遞系統(tǒng)無可比擬的（http：//vector.bcm.edu/ Lentivirus/Lentivirus_ Vectors.htm）。

由于豬在解剖、生理、生化代謝等方面與人類的十分相似，將豬用作醫(yī)學(xué)實驗動物近年來呈越來越普遍的趨勢，尤其是各種小型豬品系的建立，促進了這方面的發(fā)展與應(yīng)用。轉(zhuǎn)基因體細胞克隆豬的問世更增加了以豬作為人類疾病模型的應(yīng)用；以小型豬為材料，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因豬人類疾病動物模型，具有廣闊應(yīng)用前景。南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心顧為望教授等人［2］于2004年由西藏自治區(qū)將藏豬引種至廣州，并進行風(fēng)土馴化，經(jīng)5年培育而成了的新的小型豬品種，并將其命名為西藏小型豬（Tibetan m iniature pig）。

本研究的目的在于分離培養(yǎng)西藏小型豬胎兒成纖維細胞（porcine embryonic fibroblasts，PEFs），并進而基于慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將報告基因EGFP導(dǎo)入西藏小型豬的PEFs，以基于PEFs建立慢病毒介導(dǎo)的外源基因體外投遞系統(tǒng)，為下一步利用轉(zhuǎn)基因體細胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因西藏小型豬，進而建立相應(yīng)的人類疾病動物模型打下基礎(chǔ)；同時，該基于PEFs的外源轉(zhuǎn)基因體外投遞系統(tǒng)的建立也將為借助慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方式將 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc四種基因?qū)胛鞑匦⌒拓i的PEFs，進而將其在體外誘導(dǎo)為iPS細胞，從而建立西藏小型豬的iPS細胞系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 載體：含 EGFP報告基因的慢病毒載體pFUGW由美國Carlos Lois博士惠贈［3］，慢病毒包裝系統(tǒng)psPAX2和pMD2.G由瑞士Didier Trono博士惠贈。

1.1.2 主要試劑：質(zhì)粒提取試劑盒購自 Qiagen公司。脂質(zhì)體 LipofectamineTM 2000、高糖 DMEM、Opti-MEM? IMedium、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶和 DMSO等購自Invitrogen公司，培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等購自 Corning公司。其余試劑為國產(chǎn)或進口化學(xué)純或分析純。

1.2 方法

1.2.1 西藏小型豬胎兒成纖維細胞制備：西藏小型豬妊娠35 d，剖腹手術(shù)取出子宮，用75％的酒精浸泡消毒，無菌取出胎兒，用含雙抗的 PBS（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2）漂洗 2遍，放入含雙抗的 PBS中。將獲得的胎兒用含雙抗的 PBS洗滌3次，去除頭、四肢及內(nèi)臟，剩余部分放入10 mm平皿中，剪成1 mm3的組織碎塊，然后加入膠原酶消化液（膠原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic），轉(zhuǎn)入50 mL離心管，在37℃水浴搖床內(nèi)消化。待消化充分后，加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，離心后棄上清液，加入含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入10 mm平皿中，于 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（培養(yǎng)條件： 38.5℃、5％CO2和飽和濕度）。當原代細胞生長達80％ ～90％融合時，進行傳代。先吸除舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌2遍，棄 PBS并加入胰酶（0.25％trypsin +1 mmol/L EDTA·4Na）進行消化，37°C培養(yǎng)箱中消化約5 min，鏡下觀察細胞消化情況；當大多數(shù)細胞變圓，立即加入2 m L消化終止液（DMEM+10％ FBS）終止消化，然后仔細吹打細胞懸液，將細胞懸液收集至15 m L離心管中，700 r/m in離心10 m in。棄上清液后，再用培養(yǎng)液（DMEM+20％FBS）重懸細胞，并輕輕吹打使細胞分散均勻，傳入新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 制備攜帶EGFP基因的慢病毒：慢病毒包裝步驟參見文獻［4］和 Didier Trono博士實驗室推薦的操作步驟（http：//tronolab.ep fl.ch和 http：// www.lentiweb.com）。借助 LipofectamineTM2000將慢病毒載體 pFUGW 和包裝質(zhì)粒 psPAX2及pMD2.G轉(zhuǎn)染入293FT細胞，轉(zhuǎn)染48～72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞發(fā)光（綠色熒光）情況，待確認轉(zhuǎn)染成功后，收集病毒上清，3 000～4 000 r/ min離心15 m in，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病毒成功包裝的確認及病毒感染西藏小型豬的PEFs：將攜帶EGFP基因的病毒上清或濃縮的病毒加入內(nèi)含西藏小型豬的 PEFs的培養(yǎng)板孔內(nèi)，感染6～12 h后，用相應(yīng)培養(yǎng)基替換感染液，24～48 h后熒光顯微鏡下觀察是否見綠色熒光。

2 結(jié)果

2.1 胎兒成纖維細胞的獲得

圖1 西藏小型豬胎兒成纖維細胞 （PEFs）Fig.1 The Tibetan miniature pig embryonic fibroblasts

原代培養(yǎng)24 h后，可見細胞貼壁生長。經(jīng)過傳代培養(yǎng)，可獲得較純的胎兒成纖維細胞（PEFs），細胞呈梭形、三角形等，為典型的成纖維形態(tài)，胞質(zhì)近中央處有橢圓形胞核。成群細胞呈現(xiàn)放射狀、漩渦狀等走勢（圖1）。

2.2 慢病毒載體pFUGW鑒定

pFUGW分別經(jīng)Bam H I和Pst I單酶切，產(chǎn)物經(jīng)電泳分別可見一條帶和兩條帶，其大小與理論預(yù)測值相符（圖2）。

圖2 慢病毒載體pFUGW酶切鑒定Fig.2 Lentiviral vector of pFUGW identified by enzyme digestion

2.3 攜帶EGFP基因慢病毒的包裝與慢病毒感染西藏小型豬的PEFs

慢病毒載體pFUGW與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞，48 h后，倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功（圖3）。用經(jīng)低速離心收集的病毒上清感染PEFs，48 h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，預(yù)示病毒已成功生產(chǎn)和慢病毒成功感染PEFs，同時也表明轉(zhuǎn)基因 EGFP能夠正常表達；此外，對同一視野自然光和熒光下的圖片進行比對，發(fā)現(xiàn)慢病毒高效率感染了西藏小型豬的PEFs（圖 4，圖3，4見彩插2）。

3 討論

如前所敘，慢病毒可高效率感染處于分裂期和非分裂期的細胞，這些優(yōu)勢是其它病毒介導(dǎo)的外源基因投遞系統(tǒng)無可比擬的。為此，本研究針對西藏小型豬胎兒成纖維細胞成功建立了慢病毒介導(dǎo)的體外感染體系，這為接下來借助慢病毒將不同目的基因?qū)胛鞑匦⌒拓i的 PEFs奠定了基礎(chǔ)；基于攜帶外源轉(zhuǎn)基因的PEFs提供的細胞核可利用轉(zhuǎn)基因體細胞核移植技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因克隆西藏小型豬，進而基于它建立相應(yīng)的人類疾病模型動物模型［5］。

此外，目前，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方式均可將重編程因子基因（如Oct4、Sox2、K lf4和 c-Myc）導(dǎo)入人和動物的體細胞（如胚胎和成體的成纖維細胞），進而將其在體外重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）；iPS細胞在克隆形態(tài)、生長特性、表面標志物、基因表達模式、表觀遺傳學(xué)特征、擬胚體 （Embryoid bodies，EBs）形成、畸胎瘤（teratoma）形成和嵌合體（chimeras）形成（針對動物）等方面與胚胎干細胞（ES細胞）的非常相似；iPS細胞研究不僅具有重要理論意義，而且 iPS細胞在再生醫(yī)學(xué)、組織工程和藥物發(fā)現(xiàn)與評價等方面極具應(yīng)用價值［6］。而針對西藏小型豬的PEFs建立的慢病毒介導(dǎo)的體外感染體系將為借助慢病毒介導(dǎo)的基因投遞系統(tǒng)將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胛鞑匦⌒拓i的PEFs，進而將PEFs在體外誘導(dǎo)為 iPS細胞，從而建立西藏小型豬的 iPS細胞系，該細胞系將為開展干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究和基于西藏小型豬iPS細胞系建立轉(zhuǎn)基因豬或基因敲除豬奠定良好基礎(chǔ)。

［1］Cockrell AS，Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors［J］.Mol Biotechnol，2007，36（3）：184-204.

［2］ 顧為望，劉運忠，唐小江，等.西藏小型豬血液生理生化指標的初步研究［J］.中國實驗動物學(xué)報，2007，15（1）：60 -63.

［3］ Lois C，Hong EJ，Pease S，et al.Germ line transm ission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors［J］.Science，2002，295（5556）：868-872.

［4］ 賈俊雙，孫妍，肖東，等.慢病毒介導(dǎo)的外源基因體外投遞系統(tǒng)的建立［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8（10）：1028-1029，1037.

［5］Vodicka P，Smetana K Jr，DvoránkováB，et al.The miniature pig as an animal model in biomedical research.［J］.Ann N Y Acad Sci，2005，1049：161-71.

［6］ 申紅芬，姚志芳，賈俊雙，等.誘導(dǎo)性多潛能干細胞 （iPS cells）：現(xiàn)狀及前景展望［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，2009，36（8）：950-960.