袁樹(shù)民，張曉娟，張海濤，高 翔，高 珊，張連峰，秦 川

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

阿爾茨海默病 （Alzheimer＇s disease，AD）是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病，患者出現(xiàn)一種持續(xù)性高級(jí)神經(jīng)功能活動(dòng)障礙，即在沒(méi)有意識(shí)障礙的狀態(tài)下，記憶、思維、分析判斷、視空間辨認(rèn)、情緒等方面的障礙。其特征性病理變化為大腦皮層萎縮，記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，神經(jīng)元纖維纏結(jié) （neurofibrillary tangles，NFT）、以及老年斑 （senile plaque，SP）形成［1，2］。AD患者在發(fā)病的早期（1-3年），學(xué)習(xí)新事物困難，空間定向障礙，行為上表現(xiàn)為淡漠，偶爾出現(xiàn)易激惹，在第二階段（2 -10年）患者學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，不能計(jì)算，有時(shí)出現(xiàn)失語(yǔ)，精神上出現(xiàn)妄想，運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)表現(xiàn)為煩躁不安；第三階段（8-12年）患者智力嚴(yán)重衰退，運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)表現(xiàn)為肢體強(qiáng)直，屈曲體位［3］。

在利用動(dòng)物模型進(jìn)行的AD研究中，主要側(cè)重學(xué)習(xí)記憶能力，空間記憶能力的測(cè)試，如水迷宮實(shí)驗(yàn)，避暗實(shí)驗(yàn)，多臂迷宮實(shí)驗(yàn)等，目前關(guān)于阿爾茨海默病小鼠模型的自主活動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)的研究很少，而主活動(dòng)能力的改變是阿爾茨海默病患者的特征之一。為此，我們利用 APPswePPSΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)阿爾茨海默病小鼠模型的自主行為特點(diǎn)進(jìn)行了分析。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)所用的小鼠是我所構(gòu)建的 APPswe/ PSΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠（SCXK（京）2005-0013）10只、以及野生型C57P6J小鼠每組10只，雌雄各半；設(shè)備為：荷蘭Noldus公司Ethovision XT監(jiān)測(cè)分析軟件，Morris水迷宮系統(tǒng)；曠場(chǎng)箱；水池、平臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力變化：選用4、6、8月齡的轉(zhuǎn)基因 APPswe/PSΔE9雙轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠（TG）每組10只及同月齡的野生型C57P6J小鼠（WT）每組10只，雌雄各半。利用Morris水迷宮進(jìn)行小鼠學(xué)習(xí)記憶能力分析，我實(shí)驗(yàn)室所用的水迷宮設(shè)備為：荷蘭Noldus公司Ethovision XT監(jiān)測(cè)分析軟件，Morris水迷宮系統(tǒng) 。圓形水池直徑為100 cm，平臺(tái)在水下0.5 cm，水溫保持在22℃ ～24℃，水中加入牛奶粉，使其不透明，在水池的上方小鼠能看到的地方張貼醒目的幾何圖形，作為小鼠尋找平臺(tái)的線索。水迷宮按東南西北分為1、2、3、4區(qū)域，平臺(tái)即第5區(qū)域，位于第4區(qū)域內(nèi)。水迷宮實(shí)驗(yàn)過(guò)程分為連續(xù)5 d的隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)和第5天的空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)時(shí)，每天在同一時(shí)間訓(xùn)練小鼠2次，每次使同一只小鼠在不同區(qū)域下水，而不同的小鼠在相同的位置下水，每次游泳時(shí)間60 s，找到平臺(tái)，并在上面停留3 s以上者，視為找到平臺(tái)，60 s內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)的要將其引導(dǎo)到平臺(tái)上，停留15 s，小鼠沒(méi)有找到平臺(tái)按60 s計(jì)算潛伏期。每次訓(xùn)練間隔1 h左右?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在滴體的隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 h后立即進(jìn)行，把第五去的平臺(tái)去掉，讓小鼠在某一點(diǎn)入水，主要看小鼠在平臺(tái)區(qū)出現(xiàn)的頻次。隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)獲得能力，空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠空間記憶能力［4-6］。

1.2.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠的自主行為：水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后3 d，開(kāi)始進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，所用的計(jì)算機(jī)失蹤分析系統(tǒng)與水迷宮相同，實(shí)驗(yàn)箱為50×50 cm的曠場(chǎng)，周壁的顏色為白色（一般是與動(dòng)物的顏色相反），曠場(chǎng)底面被分成面積相等的16塊正方形格子，沿墻格稱(chēng)外周格，其余為中央格。將小鼠放在正中央格，用固定于曠場(chǎng)上方的攝象機(jī)記錄動(dòng)物一段時(shí)間內(nèi)的行為活動(dòng)情況，通過(guò)計(jì)算機(jī)示蹤分析系統(tǒng)來(lái)分析動(dòng)物在一定時(shí)間內(nèi)的活動(dòng)狀態(tài)，時(shí)間為5 m in。實(shí)驗(yàn)室要保持安靜，室溫為20℃左右，光線充足。觀察指標(biāo)：方格間穿行次數(shù)（動(dòng)物的四肢從一個(gè)格進(jìn)入另一個(gè)格為穿行一次）、直立次數(shù)（動(dòng)物雙前肢同時(shí)離地，或者雙前肢放在墻壁上算作直立一次）、中央格停留時(shí)間。穿過(guò)中央格的次數(shù)。研究認(rèn)為，經(jīng)過(guò)的格子數(shù)代表動(dòng)物的興奮性；站立的次數(shù)代表動(dòng)物對(duì)陌生環(huán)境的適應(yīng)能力［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用 spss16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析水迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠尋找平臺(tái)的潛伏期，采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析［8］，空間探索實(shí)驗(yàn)中在平臺(tái)區(qū)出現(xiàn)的頻次用單因素方差分析，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的各指標(biāo)用單因素方差分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05.被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于野生鼠，尤其在4月齡、6月齡差異具有顯著性（p＜0.05），8月齡差異減小。（圖1）空間探索實(shí)驗(yàn)：模型鼠的記憶能力也低于野生鼠，與隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)相同，在4月齡、6月齡差異較明顯，8月齡差異減小（圖2）。

圖1 不同年齡動(dòng)物隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)潛伏期分析Note：A：Comparison of the escape latency between transgenic and controlmice in age of 3 months.B：Comparison of the escape latency between transgenic and controlmice in age of 6 months.C：Comparison of the escape latency between transgenic and control mice in age of 8 months.Fig.1 Determ ination of escape latency in hidden p latform acquisition training in the mice of different ages

2.2 曠場(chǎng)結(jié)果

與野生組小鼠相比，模型組小鼠的活動(dòng)量明顯增加，模型鼠活動(dòng)無(wú)規(guī)律性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)其活動(dòng)總數(shù)，直立次數(shù)，以及在中央?yún)^(qū)出現(xiàn)的頻率，4月齡、6月齡時(shí)，高于野生型組小鼠40％ ～70％，具有顯著性差異（P＜0.05），8月齡差異減小（圖3），這與水迷宮的結(jié)果相同。

3 討論

野生小鼠與轉(zhuǎn)基因模型小鼠穿越原平臺(tái)區(qū)次數(shù)的比較 *：P＜0.05圖2 空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)區(qū)分析Fig.2 Comparison of the numbers of transgenic and control mice crossing the removed-platform

圖3 APPswe PPSΔE9與野生型小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析Note：A：Comparison of total area entries between the transgenic mice and controlmice.B： Comparison of the numbers of rears of transgenic and control mice.C：Comparison of inner/total area entries of the transgenic and controlmice.Fig.3 Comparison of the APPswe PPSΔE9 transgenic and wild type mice by open field test

根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)顯示：全球預(yù)計(jì)有3 700萬(wàn)癡呆癥患者，其中絕大部分病例都是由阿爾茨海默病導(dǎo)致的，70歲以上AD的發(fā)病危險(xiǎn)顯著增加，可以預(yù)見(jiàn)在未來(lái)的50年里，AD的發(fā)病率將增加3倍。AD發(fā)病的分子機(jī)制包括：遺傳因素、APP分解和Aβ的釋放、游離原子團(tuán)和能量代謝障礙、鈣調(diào)節(jié)失衡、脂肪因素、突觸和軸突改變、神經(jīng)元崩解、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化［9］。

APPswe/PSΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠是 APP“瑞典家族”突變和PS1第9外顯子缺失突變兩個(gè)基因的雙轉(zhuǎn)基因小鼠［10］。在3月齡開(kāi)始就出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶損傷。4.5月齡開(kāi)始出現(xiàn)老年斑，9～12月齡小鼠大腦出現(xiàn)與阿爾茨海默病患者相似的老年斑，具有和AD相似的病理表型［11］。

臨床上患者最早出現(xiàn)的行為方面的改變主要是記憶力明顯減退、思維分析、判斷能力、視空間辨別功能下降。臨床患者隨著病情的發(fā)展，在發(fā)病后的2～10年，患者出現(xiàn)空間定向障礙，不能計(jì)算，人格上出現(xiàn)易激惹，有患者出現(xiàn)妄想等精神病性癥狀。運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)表現(xiàn)為煩躁不安。Morris水迷宮廣泛用于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的視覺(jué)相關(guān)的空間記憶和工作記憶的測(cè)量中，但是否用于測(cè)量動(dòng)物的長(zhǎng)時(shí)間記憶還存在爭(zhēng)議。利用Morris水迷宮測(cè)試AD小鼠模型的學(xué)習(xí)和記憶能力是進(jìn)行AD機(jī)制研究和藥物評(píng)價(jià)的重要工具，也是目前主要的行為學(xué)測(cè)試方法。

但是在第二階段和第三階段AD患者除了學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，不能計(jì)算等學(xué)習(xí)記憶損傷之外，還出現(xiàn)妄想，煩躁不安，肢體強(qiáng)直，屈曲體位等自主運(yùn)動(dòng)等方面的行為特征［3］。而在AD的機(jī)制研究和藥物評(píng)價(jià)的過(guò)程中，應(yīng)該注意到患者出現(xiàn)妄想、煩躁不安、肢體強(qiáng)直、屈曲體位的神經(jīng)病理生理方面的基礎(chǔ)，但是由于在AD小鼠模型煩躁不安、肢體強(qiáng)直、屈曲體位等行為評(píng)價(jià)方法研究不多，限制了利用小鼠模型進(jìn)行AD自主運(yùn)動(dòng)機(jī)制和藥物評(píng)價(jià)的研究。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（open field test）又稱(chēng)敞箱實(shí)驗(yàn)，是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時(shí)間等，反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為。我們利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AD模型鼠活動(dòng)明顯增多，并且沒(méi)有規(guī)律性，頻繁的直立，穿越的總距離增加，一般情況下，小鼠具有趨暗的習(xí)性，在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為主要在邊緣區(qū)活動(dòng)，而模型鼠無(wú)目的的在狂場(chǎng)中奔跑，中央?yún)^(qū)出現(xiàn)的次數(shù)明顯大于正常小鼠，這也說(shuō)明小鼠易激惹、煩躁不安。可以利用活動(dòng)總數(shù)、直立次數(shù)以及在中央?yún)^(qū)出現(xiàn)的比率等幾項(xiàng)指標(biāo)反映小鼠的自主活動(dòng)，并和AD小鼠病情嚴(yán)重程度有相關(guān)性。在一定程度上可以反映人類(lèi)患者的煩躁不安，肢體強(qiáng)直等次能夠?yàn)樘卣?。曠?chǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)動(dòng)物模型的自主行為變化，可以用做更廣泛的藥物研發(fā)實(shí)驗(yàn)。

［1］Dickson DW.Neuropathological diagnosis of Alzheimer＇s disease： a perspective from longitudinal clinicopathological studies［J］.Neurobiol Aging，1997，18（4 Suppl）：S21-26.

［2］Braak H，Braak E.Evolution of neuronal changes in the course of Alzheimer＇s disease［J］.JNeural Transm，1998，53（Supp l）： 127-140.

［3］ 盛樹(shù)立，主編.老年性癡呆及相關(guān)疾?。跰］.科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2006：75-78.

［4］Shiryaev N，Jouroukhin Y，Giladi E，et al.NAP protects memory，increases soluble tau and reduces tau hyperphosphorylation in a tauopathy model［J］.Neurobiol Dis，2009，34（2）：381-388.

［5］ Cox MM， Tucker AM， Tang J， et al. Neurobehavioral abnormalities in the dysbindin-1 mutant，sandy，on a C57BL/6J genetic background［J］.Genes Brain Behav，2009，8（4）：390 -397.

［6］Imbimbo BP，Hutter-Paier B，Villetti G，et al.CHF5074，a novel gamma-secretase modulator，attenuates brain beta-amyloid pathology and learning deficit in a mouse model of A lzheimer＇s disease［J］.Br JPharmacol，2009，156（6）：982-993.

［7］Swiergiel AH， Dunn AJ. Effects of interleukin-1beta and lipopolysaccharide on behavior ofmice in the elevated p lus-maze and open field tests［J］.Pharmacol Biochem Behav，2007，86 （4）：651-659.

［8］ 邱宏，金國(guó)琴，金如鋒，等.水迷宮重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析及其在SPSS中的實(shí)現(xiàn)［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007，5 （1）：101-105.

［9］Mattson MP.Pathways towards and away from Alzheimer＇s disease［J］.Nature，2004，430（7000）：631-639.

［10］Sherrington R.Cloning of a gene bearing m issense mutations in early-onset familial A lzheimer＇s disease［J］.Nature，1995，375 （6534）：754-760.

［11］ 宗媛媛，王曉映.APPPPS雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型的老年斑及行為學(xué)動(dòng)態(tài)分析［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（9）：9-12.