劉可越， 劉海軍， 吳家忠， 高春華， 劉建云， 李雪芹， 周 斌

(1.九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西省高等學(xué)校系統(tǒng)生物學(xué)臨床應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 九江332000;2.江西科技師范學(xué)院，江西南昌330000)

粟米草是番杏科植物Mullugo pentaphylla L.，為東南亞國家的傳統(tǒng)草藥，具有清熱解毒、抗菌利濕的功效，主治腹痛泄瀉、瘡癤腫毒、風(fēng)疹等癥［1］。我國粟米草藥用資源豐富，主要分布于江西省及華南大部分地區(qū)，以全草入藥。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，粟米草具有抗癌、殺精、抗心律失常、降壓等藥理作用［2-5］。埃及科學(xué)家曾報(bào)道粟米草根中具有能顯著抗癌的化學(xué)成分，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性 IC50僅為0.018 μmol/L。而粟米草在民間常作為治療瘡癰腫毒，“癰癥”即包括現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腫瘤疾病，因此用粟米草治療腫瘤有一定開發(fā)價(jià)值。然而近年來并未見其抗腫瘤方面的相關(guān)報(bào)道，因此為了探討其抗腫瘤的活性，充分利用豐富的藥源，筆者對(duì)粟米草的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，并采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)和瓊脂糖凝膠電泳法研究化合物體外對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞增殖的影響。以期為粟米草抗腫瘤作用及其機(jī)理的深入研究和探索中藥粟米草在腫瘤治療應(yīng)用方面的前景提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

粟米草藥材采自江西省九江市廬山周邊，經(jīng)鑒定為粟米草屬(Mullugo)植物粟米草(Mullugo pentaphylla L.)，標(biāo)本保存于九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院廬山特色藥用植物研究所。熔點(diǎn)用X-4顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定，溫度計(jì)未校正;質(zhì)譜用Thermo Finnigan LCQ advantage型質(zhì)譜儀測(cè)定;核磁共振氫譜、碳譜用Bruker AV-400核磁共振儀測(cè)定;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma);層析用硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品，Sephadex LH-20柱層析填料購于Pharmacia公司。所用試劑均為分析純。紫杉醇為北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料公司產(chǎn)品，RPM11640和胰蛋自酶購自美國GIBCO公司，SDS為美國Biotec公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡(德國Leica公司);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國Bio-Rad公司)。腫瘤細(xì)胞株:人子宮頸癌細(xì)胞株Hela(購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所)。

1.2 提取與分離

粟米草干燥全草3 kg，切成1～2 cm小段，用10倍量80%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h。合并提取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物浸膏90.5 g。該醇提物懸浮于水中，以石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，回收有機(jī)溶劑，得各部位萃取物。取石油醚部位萃取物15 g，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(20∶1→1∶1)梯度洗脫，得9個(gè)組分(Fr.P1-9)。其中Fr.P3(3.0 g)，F(xiàn)r.P4(2.3 g)和Fr.P9(3.6 g)分別經(jīng)硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(15∶1→2 ∶1)洗脫，得化合物1(22 mg)、2(10 mg)、3(25 mg)。取乙酸乙酯部位萃取物26 g，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(5∶1→0∶1)梯度洗脫，得8個(gè)組分(Fr.E1-8)。Fr.E1組分經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，以甲醇洗脫，得化合物4(15 mg)。Fr.E8組分經(jīng)減壓回收溶劑分別出現(xiàn)顆粒狀沉淀，經(jīng)PHPLC純化的化合物5(12 mg)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色片狀結(jié)晶(石油醚-乙酸乙酯5∶1)，mp 288～289℃，與表木栓醇對(duì)照品薄層色譜Rf值及顯色行為一致。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)∶16.38(C-1)，35.31(C-2)，72.53(C-3)，49.38(C-4)，37.64(C-5)，41.74(C-6)，17.23(C-7)，53.39(C-8)，37.12(C-9)，61.58(C-10)，35.43(C-11)，30.26(C-12)，38.67(C-13)，39.56(C-14)，32.63(C-15)，36.02(C-16)，30.05(C-17)，42.55(C-18)，35.65(C-19)，28.34(C-20)，32.88(C-21)，39.62(C-22)，11.60(C-23)，15.59(C-24)，18.12(C-25)，18.60(C-26)，20.10(C-27)，32.06(C-28)，34.99(C-29)，31.78(C-30)。其熔點(diǎn)、色譜行為及13C-NMR(CDCl3)資料均與文獻(xiàn)報(bào)道［6］一致，結(jié)果該化合物鑒定為表木栓醇。

化合物2:白色顆粒狀結(jié)晶(石油醚)，mp 82～84℃。紅外光譜顯示其為長鏈脂肪醇特征譜峰。EI-MS m/z∶453［M+1］+，421，153，125，97，83，71，57，43。質(zhì)譜顯示直鏈脂肪醇特征裂解，確定該化合物為三十一烷醇。

化合物3:白色針晶(乙酸乙酯)，mp 140～141℃，硫酸顯色呈綠色。與β-谷甾醇對(duì)照品薄層色譜Rf值及顯色行為一致，1H-NMR(CDCl3)與13C-NMR(CDCl3)資料與文獻(xiàn)報(bào)道［7］一致，確認(rèn)其為 β-谷甾醇。

化合物4:黃色粉末(氯仿-甲醇)，mp 258～259℃，EIMS m/z 433［M+1］+。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ ∶8.01(2H，d，J=8.6 Hz，H=2′，6′)，6.83(2H，d，J=8.6 Hz，H=3′，5′)，6.76(1H，s，H-6)，6.25(1H，s，H-3)，4.65(1H，d，J=9.9 Hz，Glc H-1).13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ:163.91(C-2)，101.86(C-3)，181.93(C-4)，158.92(C-5)，98.32(C-6)，162.28(C-7)，103.92(C-8)，160.81(C-9)，104.56(C-10)，121.68(C-1′)，128.90(C-2′，6′)，116.12(C-3′，5′)，161.63(C-4′)，Glu 信號(hào) C-1″～C-6″:79.32，73.56，71.27，70.53，81.65，61.56. 以上波譜資料與文獻(xiàn)［8］中牡荊素報(bào)道一致，確認(rèn)其為牡荊素。

化合物5:淡黃色針晶(石油醚-乙酸乙酯)，mp 316～317℃，Mg-HCl反應(yīng)陽性，與槲皮素對(duì)照品薄層色譜Rf值及顯色行為一致，ESI-MS m/z(%)∶303［M+1］+。13C-NMR(DMSO-d6)δ:146.90(C-2)，122.09(C-3)，176.16(C-4)，156.17(C-5)，93.56(C-6)，164.32(C-7)，98.32(C-8)，160.95(C-9)，103.21(C-10)，135.93(C-1′)，115.84(C-2′)，147.89(C-3′)，145.24(C-4′)，115.39(C-5′)，120.26(C-6′)。13C-NMR(DMSO-d6)數(shù)據(jù)均與文獻(xiàn)報(bào)道［9］一致，化合物鑒定為槲皮素。

3 化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的體外抑制作用

3.1 腫瘤細(xì)胞抑制率的測(cè)定

人宮頸癌Hela細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基內(nèi)含青、鏈霉素各100 U/mL，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d傳代一次。樣品以DMSO溶解，用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋，DMSO稀釋后最終濃度小于0.05%。將HeLa等腫瘤細(xì)胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔50 μL(含1×104個(gè)細(xì)胞)，分別加入空白對(duì)照磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對(duì)照(二甲基亞砜)、陽性對(duì)照(紫杉醇)以及不同濃度單體化合物(10、50、80、100、150、200、300、500 μg/mL)，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于飽和濕度、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入反應(yīng)停止液150 μL，靜置1 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，測(cè)定波長λ=570 nm，并計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率。增殖抑制率(%)=(1-含藥孔OD平均值/對(duì)照孔OD平均值)×100%。

3.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析［10］

將對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，3個(gè)皿內(nèi)加入化合物5，同時(shí)做空白對(duì)照，分別于12 h、24 h、48 h后取出。收集細(xì)胞，以PBS洗3次，加Tris飽和酚沉淀蛋白，加酚離心抽提，取上清液，加入冷無水乙醇，析出DNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結(jié)果并拍照。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖的影響

結(jié)果表明:化合物1、4、5對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela均顯示出一定的抑制作用，其中化合物4、5抑瘤作用較顯著。見表1。

表1 化合物抗腫瘤活性篩選結(jié)果

4.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析

結(jié)果顯示:Hela細(xì)胞在化合物5的作用下，分別處理24 h、48 h和72 h后，細(xì)胞凋亡時(shí)基因組DNA被特異性核酸內(nèi)切酶水解成小分子片段，經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的梯狀條帶;而對(duì)照組Hela細(xì)胞DNA完整，具體見圖1。

5 討論

5.1 宮頸癌是最常見婦科惡性腫瘤之一，世界每年新發(fā)病例約50萬，我國發(fā)病率和病死率約占世界的1/3［11］。宮頸癌治療手段通常包括手術(shù)、化療及放療。但化療藥物的毒副作用及對(duì)機(jī)體的損害制約了其臨床應(yīng)用。而中藥中存在著毒副作用小的天然生物活性物質(zhì)，具有廣闊的開發(fā)前景。實(shí)驗(yàn)證明粟米草中含有的化合物可抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖作用，從活性的角度說明粟米草抗癌方面具有進(jìn)一步開發(fā)價(jià)值，為應(yīng)用粟米草治療癌癥提供了理論依據(jù)。

圖1 化合物5處理后的Hela細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳現(xiàn)象

5.2 惡性腫瘤的發(fā)生是多基因突變的細(xì)胞失控性生長，細(xì)胞增殖失控和凋亡受阻是其發(fā)生、發(fā)展的主要原因［12］，有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的新方法之一［13］。本研究表明槲皮素素可體外誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡呈時(shí)間依賴關(guān)系。DNA凝膠電泳確證槲皮素作用Hela細(xì)胞72h出現(xiàn)典型“梯形”DNA條帶。上述結(jié)果提示槲皮素可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有效抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長。需要分離粟米草中更多的化學(xué)成分，研究其體外及體內(nèi)的抗腫瘤活性，為將粟米草開發(fā)成新型抗腫瘤藥物提供依據(jù)。

5.3 牡荊素和槲皮素化合物結(jié)構(gòu)母核均為黃酮體，差異是取代基位置不同，并且牡荊素為碳苷，槲皮素為氧苷。牡荊素和槲皮素的抗癌作用已有不少報(bào)道［14-16］。筆者前文報(bào)道過黃酮苷與苷元抗腫瘤的構(gòu)效關(guān)系，初步總結(jié)母核相同的黃酮氧苷一般較苷元抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用弱。黃酮碳苷和氧苷抗癌作用與其結(jié)構(gòu)有何關(guān)系是值得進(jìn)一步探討的問題。

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